小麦籽粒响应花后早期高温胁迫的形态和细胞学研究

冯宽 ，李咏 ，林静 ，赵云 ，石培春 ，李召锋 ，李卫华 *

（1石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆 石河子832003；2哈密市巴里坤县农产品质量安全检验检测中心，新疆 哈密 839000）

小麦（Triticum aestivumL.）是我国重要的粮食作物，小麦的产量与品质的形成不仅受遗传特性等内在因素的影响，而且与生态环境和栽培措施等一系列手段密切相关[1]。温度和水分是影响小麦生长的重要因素，对籽粒贮藏物质的形成具有极其重要的作用。小麦籽粒发育的适宜温度为20-24℃[2]，高温是新疆地区小麦灌浆期遭受的主要灾害之一，6月上旬至6月下旬经常遭遇干热风天气，此时节正值小麦开花至乳熟期，大气温度骤升，日最高温度达35℃[3]，容易导致籽粒产量和品质下降。小麦籽粒形成期，高温导致籽粒发育不良，叶片叶绿体受损，叶绿素降解，植株衰老加速，灌浆期缩短，产量下降[4]。在一定范围内小麦成熟期的平均温度与成熟期的长短之间存在负相关[5]。灌浆期间日平均气温15.8-27.7℃范围内日均温每增加1℃，粒灌浆持续时间缩短3.1 d，粒重下降2.8 mg[6-8)。封超年等[9]研究发现，花后不同时期高温处理在短时间提高胚乳细胞分裂速率。王磊等[10]研究发现不同剂量的热激可以诱导烟草产生PCD，随着热激处理温度的升高，DNA已经开始解体，出现凋亡现象。前人着重研究高温对小麦籽粒灌浆速率及最终产量的影响，但对花后不同生育期籽粒发育动态及细胞学的影响报道较少。

因此，本研究应用人工气候室培养盆栽小麦，在花后5-8 d进行高温处理，探讨花后早期高温胁迫下小麦籽粒形态学、细胞学变化，以期明确小麦籽粒响应花后高温胁迫的生理机制。揭示花后高温胁迫对小麦籽粒形态和细胞学的影响，为小麦响应逆境胁迫提供一定理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为新疆主栽春性、中熟小麦品种新春11号，由石河子大学麦类作物研究所提供，实验用种均来自2016年夏天收获的种子。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

实验于2016年9月至12月在石河子大学绿洲生态农业重点实验室人工气候室（日平均气温20℃-25℃）中采用盆栽进行。盆直径25 cm，深30 cm，盆土为基质∶蛭石=3∶1混合而成，每盆土重 1.5 kg左右。测得土壤全氮含量1.1 g/kg，速效磷含量为38.49 mg/kg，速效钾含量126.39 mg/kg，于三叶期、拔节期和灌浆初期结合浇水每盆分别追施二胺、尿素和硫酸钾，施肥量同中等产量水平田间正常管理用量，其它管理措施按小麦常规栽培技术规程进行。播种时每盆播20粒种子），播种后2周间苗，每盆保留8～10棵苗。标记生长一致且同天开花的单穗（每穗有2～3个小穗有花药抽出即标记为开花）作为实验材料，于花后5 d将材料移入温光可控培养箱进行高温处理（High Temperature，HT），处理期昼/夜温度为35/18℃，于正午12：00开始处理至下午17：00结束，连续处理至花后8d，处理结束后移至人工气候室正常生长。未进行高温处理的材料作为对照（Control，CK），分别于花后 10、15、20、25 d 和 30 d取样，剥取穗中下部籽粒，各时期籽粒置于液氮中速冻30 min，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 测定项目

1.2.2.1 籽粒长、宽、厚的测定

剥取麦穗中下部小穗的优势粒，随机选取10粒小麦籽粒，将籽粒首尾相接排成一行，测定其长度，以10粒籽粒的平均值作为单个籽粒的长度（mm），重复测定三次；10粒籽粒其肩并肩排列成一行，测定其长度，重复测定三次，最后求平均值，作为单籽粒的宽度（mm）；在背景纸上贴上双面胶，然后将种子侧放在双面胶上，测定其厚度，重复测定3次，最后求平均值作为籽粒的厚度（mm）。

1.2.2.2 籽粒鲜、干重的测定

随机数取各时期籽粒100粒，称取其鲜重；然后105℃烘15 min杀青，70℃烘8 h左右至恒重，测定籽粒干重。各时期材料3次重复测定。

1.2.2.3 胚乳细胞数目测定

采用郭文善等[11]胚乳细胞简易计数方法进行。

1.2.2.4 颖果发育的观察

参照康海岐等[12]方法，采用石蜡切片法进行籽粒组织结构观察，将制成的切片在装有CCD相机的光学显微镜（DMLS，德国LEICA公司）下观察并拍照。每组选取小穗中下部3个颖果作为重复，每个颖果来自不同麦穗。

1.2.2.5 Evans Blue染色检测胚乳PCD发生位置

染色方法参照Young等[13]的文献方法。

1.2.3 数据统计与分析

采用WPS Excel 2016软件进行数据处理及作图，用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行各指标的方差分析和显著性检验。图表的制作采用Photoshop图像处理软件。

2 结果与分析

2.1 花后高温对小麦籽粒形态的影响

2.1.1 花后早期高温对小麦籽粒形态和粒径的影响

小麦籽粒发育过程颖果形态变化如图1所示，随籽粒发育进程，颜色逐渐由绿变黄，高温处理后的籽粒颜色由绿转黄开始较早，且程度较深，尤其花后30 d颜色变化明显。籽粒体积变化除花后10 d大于对照外，其它各时期籽粒体积均小于对照，具体籽粒长、宽、厚度的变化见图1。

图1 籽粒发育不同时期籽粒颜色和形态变化Fig.1 Grain color and morphological changes in different stages of grain development

从图1中可以看出，花后早期高温显著影响小麦籽粒粒径，籽粒长、宽、厚均于花后25d达最大值，此后粒径有一定程度减小（图2-A、B、C）。花后10d高温处理小麦籽粒长、宽显著大于对照，分别比对照高2.52%、6.98%（图 2A、2B），籽粒厚度比对照高4.32%但差异不显著（图2C）；花后 15 d以后高温处理小麦粒径均小于对照，其中籽粒长度、宽度显著小于对照，花后30d籽粒长度、宽度分别比对照高1.52%、2.96%。花后20、30 d时籽粒厚度与对照相比差异不显著。

图2 花后不同时期籽粒的长度、宽度和厚度Fig.2 The length，width and thickness of grain at different stages after anthesis

2.1.2 花后早期高温对小麦籽粒粒重的影响

小麦籽粒发育过程中籽粒鲜、干重的动态变化见图 3。

图3 花后不同时期小麦籽粒的鲜重和干重变化Fig.3 .Changes of fresh weight and dry weight of wheat grains at different stages after anthesis

由图3可知，随着小麦籽粒的发育，花后早期高温处理对籽粒鲜重有显著影响。花后早期高温处理与对照的鲜重最大值出现时期均在花后25 d，以后籽粒鲜重即迅速下降，而籽粒干重呈持续上升趋势。花后10 d高温处理小麦籽粒鲜、干重均显著高于对照，分别比对照高6.71%、9.63%，而花后15 d后，籽粒的鲜、干重显著低于对照。这表明早期高温处理在小麦籽粒发育早期促进籽粒生长，显著增加其鲜、干重，而在籽粒发育后期对籽粒充实造成影响，从而使得粒重显著降低。

2.2 花后早期高温对籽粒胚乳细胞发育的影响

2.2.1 花后早期高温对籽粒胚乳细胞数量的影响

小麦籽粒发育过程中胚乳细胞数量的动态变化见图4。由图4可知，随着小麦籽粒的发育，籽粒胚乳细胞数量呈先升高后降低的趋势，高温处理与对照胚乳细胞数量均在花后15 d达最大值。花后10-15 d，对照处理籽粒胚乳细胞数目显著上升，增殖速率为10592个/日，此后胚乳细胞数目持续下降。与对照相比，高温处理显著增加籽粒花后10 d胚乳细胞数目，此后显著降低胚乳细胞数目，其花后10-15 d胚乳细胞增殖速率为2697.6个/日，亦明显低于对照。上述结果表明，花后高温胁迫在颖果发育早期促进胚乳细胞的分裂，增加胚乳细胞数量，进而促进胚乳的发育，但随着发育进行，胚乳发育受到抑制。

图4 花后不同时期小麦籽粒胚乳细胞数目的变化Fig.4 Changes of endosperm cell number in wheat grains at different stages after anthesis

2.2.2 花后早期高温对胚乳细胞程序性死亡的影响

为观察花后早期高温胁迫下小麦籽粒胚乳PCD发生过程，本研究通过Evan's Blue染色法检测小麦籽粒横切面胚乳细胞的生活力（图5），死细胞细胞膜通透性变差，Evan's Blue染色可将其染成蓝色，而活细胞不着色。从图5可以看出，高温处理与对照在籽粒发育初期（10 d）胚乳细胞不着色，其着色部位主要集中在果皮。花后15 d开始检测到胚乳着色，且随着籽粒发育进程，着色逐渐加深，直到发育中后期（花后25-30 d）胚乳细胞被染成深蓝色。高温处理组，在花后10 d与对照组无明显差异，花后15、20、25、30 d着色程度要明显高于同时期对照处理组，说明高温使胚乳细胞生活力大大下降。

图5 花后不同时期胚乳细胞Evan's Blue染色Fig.5 Evan's Blue staining of endosperm cells at different stages after anthesis

2.3 花后高温对小麦颖果发育的影响

2.3.1 对果皮发育的影响

花后早期高温对果皮发育的影响主要表现为果皮细胞凋亡等的变化。由图6可看出，花后10 d高温处理的小麦颖果中果皮细胞层数为3层，而同时期对照中果皮层数为4层，且高温处理小麦颖果中果皮细胞排列较对照更为紧密（图6A、6B）。到花后15 d，高温处理小麦颖果仍有一部分中果皮未凋亡，但中果皮层数少于花后10 d，而同期对照小麦颖果中果皮几乎全部凋亡，且可以观察到细胞凋亡留下的空腔（图6C、6D）。此外，高温处理颖果外果皮细胞壁的加厚程度要明显高于对照。花后20-30 d只能观察到加厚的外果皮，此外，在果皮发育过程中，果皮厚度不断降低，而且高温处理小麦果皮厚度在10 d前低于对照，此后两者之间无明显差异（图6E-6G）。由此可看出，花后高温在小麦颖果发育早期促进了果皮的发育，此后随着颖果的发育，果皮的发育受到抑制，这表现在中果皮细胞凋亡的速度减缓。

图6 花后不同时期小麦果皮发育图Fig.6 Wheat peel development at different stages after anthesis

2.3.2 对胚发育的影响

图7显示了花后高温处理前后小麦颖果胚的发育过程，因花后25 d以后的籽粒浸蜡困难，所切出的蜡带中胚组织总是与蜡带分离，无法进行切片研究。

图7 花后不同时期小麦胚发育图Fig.7 Wheat embryos development at different stages after anthesis

因此只获得了花后10、15 d和20 d的小麦颖果胚发育的切片，采用Image-Pro Plus软件统计胚面积的变化。

由图7可以看出，花后10 d高温处理与对照小麦胚的大小无明显差异，但胚周围细胞排列更紧密，空隙更小，胚细胞分裂更为活跃（图7A、7B）。花后15 d，胚分化出盾片、胚芽鞘和胚根鞘，花后高温处理下小麦胚还分化出胚根，并且胚的大小要高于对照。这表明花后高温促进了胚的发育，加速了胚发育分化的进程（图7C、7D）。到花后20 d，胚进一步发育，继续分化出胚芽和胚根，高温处理小麦胚分化的更完全，但是胚的尺寸变小。

以上结果表明，花后早期高温影响了小麦胚的发育进程，在发育前期，胚分化发育的进程加快，有利于胚的生长；发育中后期，胚的进一步发育受到抑制，这主要表现在胚体积扩大的抑制。

3 讨论

3.1 花后早期高温对小麦籽粒形态的影响

植株在经过逆境胁迫后，其组织结构和渗透调节物质通过主动或被动的调整来适应外界逆境[14]。花后5-8 d高温处理后，籽粒鲜重、干重的增长速率短时间内大于常温对照，但可能由于叶片光合产物供应能力的降低，表现为灌浆能力的衰退，平均灌浆速率下降对最终粒重造成显著影响。花后15-25 d，籽粒胚乳细胞数已经确定，以胚乳细胞充实为主[15]，此时高温阻碍了籽粒中光合产物积累，缩短了胚乳细胞中物质沉积期，表现为籽粒中胚乳细胞充实不良，籽粒重上升缓慢，最终降低了胚乳细胞中物质沉积量，显著地降低了最终粒重。花后25-30 d，籽粒已接近成熟，此时需要的灌浆物质已不多，高温可能对籽粒成熟过程起到阻碍作用，或者是缩短了物质的有效转运时间，致使光合产物积累量显著下降，粒重显著降低，最终在籽粒形态上表现为籽粒粒径低于对照，且表面皱缩。

3.2 花后早期高温对籽粒胚乳PCD的影响

花后5-8 d高温短时间加速了胚乳细胞发育的进程，胚乳细胞数上升加快，但与此同时也加快了胚乳PCD进程，从而显著减少最终胚乳细胞数。Evan's Blue染色可清楚观察地观察到小麦果皮、胚乳在发育过程中细胞死亡的发生过程。将死细胞染成蓝色，而活细胞不着色。在花后15 d前是胚乳细胞快速增长积累时期，同时死亡的胚乳细胞数也迅速增加；花后20 d后，胚乳细胞数目有一定下降，胚乳大部分被染成蓝色，而此时胚开始快速发育，种子中的营养积累开始转向胚。胚乳是如何调节其一边死亡一边继续积累淀粉的任务呢？目前对于此问题尚无定论，有研究认为部分mRNA可以选择性表达，从而保持细胞质中的代谢活动[16]。小麦胚乳中PCD的发生部位具有随机性，这和水稻籽粒的观察结果一致[17]，而玉米胚乳中PCD是从中上部开始[18]，说明物种间存在差异。

3.3 花后早期高温对小麦颖果发育的影响

在小麦颖果发育过程中，果皮细胞很早就开始出现细胞程序性死亡（PCD）过程，果皮变薄，厚度不断减小。Xiong等[19]根据外、中、内果皮的整体发育阶段以及中果皮中淀粉的动态积累，将果皮的发育分为生长期、形成期、消失期和成熟期4个时期。有研究[20-22]表明，环境因素在作物果皮的发育过程中具有重要的作用，比如CO2浓度、光照强度以及干旱胁迫均会影响果皮的发育。本研究结果表明，从花后15 d开始，果皮发育减缓，花后高温处理后中果皮细胞层数高于对照水平。这可能由于小麦为应对早期的高温逆境，加速生长进程，果皮凋亡提前，从而促进果皮发育，且高温处理小麦颖果果皮细胞壁加厚，这可能是由于加厚的细胞壁能够保水，减少水分蒸发，从而使小麦更好地应对高温逆境造成的，而随着发育的持续，果皮发育进一步受阻，果皮细胞凋亡速率减慢，从而抑制果皮发育。

小麦在受精后胚乳细胞经过核分裂形成合胞体，一般认为花后4 d左右，胚乳游离核形成细胞壁，合胞体时期结束，细胞化时期开始。Begcy等[23]认为，胚乳合胞体时期向细胞化时期的过渡对颖果的发育十分重要，合胞体时期的持续以及细胞化的时间会影响籽粒的大小和重量。本研究中，遭花后高温处理的小麦在花后10 d胚乳细胞数显著多与常温处理小麦胚乳。其原因可能是，花后高温处理缩短了籽粒的发育时间，加速了发育过程，使得胚乳合胞体时期减短，细胞化提前，因此同一时期，花后高温处理下小麦胚乳细胞数多。Wardlaw[24]研究也表明，在小麦开花后的前10 d，由于胚乳细胞分裂速率的增加，高温胁迫下小麦颖果在早期具有较大的生长速率。此外本研究还发现花后高温处理后，小麦胚分化更早，胚的面积在早期也高于对照，这些均表明花后高温对胚发育的促进。Westgate等[25]也观察到早期干旱和高温共同胁迫下小麦扩大的胚和胚乳等类似组织学结果，并通过微阵列芯片分析了胚和胚乳中响应干旱和高温的编码储藏蛋白基因、糖和淀粉代谢相关酶、组蛋白、热激蛋白、蛋白酶、水孔蛋白以及一些转录因子等调控分子。然而在颖果发育中期，高温对胚和胚乳的发育有着消极的影响，胚乳细胞数和胚的面积低于正常水平，形成一个更小但有功能的成熟胚。这可能是花后高温减少颖果灌浆的持续时间，促进颖果早衰，限制细胞水分的吸收和干物质的积累，从而阻碍了胚和胚乳体积的扩大，抑制颖果进一步生长[25]。发育后期，由于小麦变硬，花后25 d和30 d的籽粒石蜡切片很难制备，因此无法观察籽粒发育后期胚的变化。

高温是主要的非生物胁迫之一，影响作物的生理特性、基因表达和蛋白质合成，进而影响作物的形态、花粉育性、籽粒灌浆，最终导致产量降低和品质下降。本研究从生理生化水平和细胞学水平研究小麦对高温胁迫的响应，综合分析花后早期高温胁迫对小麦的影响，为进一步了解小麦耐热性机制，及深入研究小麦响应逆境胁迫提供参考。