干旱胁迫下转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片光合及叶绿素荧光特性的比较

刘 彧， 王 琳， 杨伊如， 何 淼， 周蕴薇

(东北林业大学园林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)

露地菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)具有植株低矮、花期长、花色丰富、抗性强及管理粗放等特点，是华北和东北地区园林绿化建设中重要的地被植物材料[1]。干旱对露地菊的生长和观赏价值有严重影响，因此，提高露地菊的适应性，拓宽其应用区域，尤其在土壤瘠薄和干旱地区的绿化具有重要意义。

NAC转录因子是一类家族庞大且广泛存在的植物特异性转录因子，是具有多种生物功能的调控蛋白。NAC基因家族编码的蛋白质在N端均含有一段约150个氨基酸组成的保守区域，C端是转录调控区，具有促进或抑制转录活性的功能[2-3]。已有研究结果表明：一些NAC转录因子可以被至少1种非生物胁迫诱导并应答[4]。从黄花蒿(ArtemisiaannuaLinn.)中克隆的AaNAC1基因可能是应激信号通路的关键调节器，当AaNAC1基因在拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中过表达时，转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性增强，并且对灰葡萄孢的抗性增强[5]；过表达TaNAC2基因的转基因拟南芥对NaCl胁迫和干旱胁迫的抗性均有所提高[6]；过表达PtrNAC72基因的转基因烟草(NicotianatabacumLinn.)也表现出对干旱胁迫耐受性增强的特征[7]。但目前尚未见有关转NAC基因露地菊抗旱性方面的评价研究。

植物中能量的转化和合成主要通过光合作用来完成，植株的生长情况与光合速率有直接关联。一方面，光合速率影响植物的能量转化和物质累积；另一方面，植物的生长情况，如生长环境是否适宜，是否受生物及非生物胁迫，也会在光合指标中得到体现。叶绿素荧光与光合作用关系密切，以叶绿素为探针，可以快速并更加敏感地探测植物的光合功能情况[8]、生长和生理状况以及生物胁迫对植株内在的影响[9-10]。水分变化对光合作用的影响十分明显，水分缺失情况下植物光合效率低，不能及时消耗吸收的光能，从而损伤光合器官，致使光合电子传递链和PSⅡ反应中心被破坏[11-13]。

作者所在课题组的前期研究中将ClNAC9基因转入露地菊品种‘纽9717’(‘Niu 9717’)[14]，本研究对露地菊品种‘纽9717’的野生型和3个转ClNAC9基因株系进行干旱胁迫处理，并对不同干旱胁迫时间叶片的叶绿素含量以及光合和叶绿素荧光特性进行比较，研究ClNAC9基因的转入对露地菊品种‘纽9717’抗旱性的影响，以期为扩大露地菊的园林应用范围提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为作者所在实验室保存的露地菊品种‘纽9717’的野生型(WT)和3个转ClNAC9基因株系(ClNAC9-5、ClNAC9-6和ClNAC9-13株系)的组培苗。待组培苗根长约1.5 cm时，移至装有草炭土和蛭石(体积比1∶1)的混合培养基质中。人工气候培养室温度21 ℃～25 ℃，空气相对湿度30%～40%。经过6周培养，植株长出6～7对真叶后，将培养基质浇至水分饱和，然后采取自然失水的方法对野生型以及ClNAC9-5、ClNAC9-6和ClNAC9-13株系进行干旱胁迫处理，其中，野生型为对照。对干旱胁迫0、5、10和15 d 4种材料植株的形态进行拍照，同时进行取样，然后对叶片的叶绿素含量以及光合和叶绿素荧光参数进行测定。

1.2 方法

1.2.1 叶绿素含量的测定 每种材料随机选取3株，每株选择植株中部生长良好且无病虫害的叶片5枚，用铝箔包好，经液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存。叶片中叶绿素含量参考Wang等[15]的方法进行测定。重复测定3次。

1.2.2 光合参数的测定 于晴朗无云日的上午9：00—11：00，每种材料随机选取3株，每株选择植株中上部生长良好且无病虫害的功能叶1枚并标记，分别于干旱胁迫0、5、10和15 d使用LI-6400XT便携式光合仪(美国LI-COR公司)测定各植株叶片在光照强度1 200 μmol·m-2·s-1下的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和水分利用效率(WUE)。每次测定重复读数3次，结果取平均值。

1.2.3 叶绿素荧光参数的测定 于晴朗无云日的上午9：00—11：00，每种材料随机选取3株，每株选择植株中上部生长良好且无病虫害的功能叶1枚并标记，分别于干旱胁迫0、5、10和15 d后暗处理约12 h，使用LI-6400XT便携式光合仪，加载荧光LCF配置系统，采用叶室荧光测定各植株叶片的初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在光化学活性(Fv/Fo)、光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)。每次测定重复读数3次，结果取平均值。

1.3 数据统计处理

采用EXCEL 2007和SPSS 19.0统计分析软件对实验数据进行处理和分析。

2 结果和分析

2.1 干旱胁迫下转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片中叶绿素含量的比较

不同干旱胁迫时间转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片中叶绿素含量见表1。由表1可见：干旱胁迫0、5、10和15 d，3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量高于或显著(P<0.05)高于野生型。干旱胁迫0～15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量总体上呈先升高后降低的变化趋势，其中，野生型叶片中叶绿素含量于干旱胁迫5 d达到峰值，3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量均于干旱胁迫10 d达到峰值。干旱胁迫0 d，3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量显著高于野生型；干旱胁迫5 d，野生型以及ClNAC9-6和ClNAC9-13株系叶片中叶绿素含量较干旱胁迫0 d有所升高，而ClNAC9-5株系叶片中叶绿素含量略有降低；干旱胁迫10 d，野生型叶片中叶绿素含量较干旱胁迫5 d降低，而3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量略有升高；干旱胁迫15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量均较干旱胁迫10 d明显降低，且3个转ClNAC9基因株系叶片中叶绿素含量显著高于野生型。

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 转ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

2.2 干旱胁迫下转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片光合参数的比较

不同干旱胁迫时间转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片的光合参数见表2。由表2可见：干旱胁迫0～15 d，野生型叶片净光合速率(Pn)持续降低，而3个转ClNAC9基因株系叶片Pn值均呈先升高后降低的变化趋势，且均于干旱胁迫5 d达到最高值。干旱胁迫15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Pn值均降到最低，其中，野生型叶片Pn值显著(P<0.05)低于3个转ClNAC9基因株系。总体上看，不同干旱胁迫时间ClNAC9-5株系叶片Pn值最高，野生型叶片Pn值最低，二者间差异达到显著水平。

由表2还可见：干旱胁迫0～15 d，野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系叶片气孔导度(Gs)呈先升高后降低的变化趋势，ClNAC9-6株系叶片Gs值呈逐渐降低的变化趋势。干旱胁迫0 d，ClNAC9-6株系叶片Gs值显著高于野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系；干旱胁迫5 d，ClNAC9-6株系叶片Gs值较干旱胁迫0 d降低，而野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系叶片Gs值略有升高；干旱胁迫10和15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Gs值均不同程度降低，其中，野生型叶片Gs值的降幅最大，3个转ClNAC9基因株系叶片Gs值显著高于野生型。

由表2还可见：干旱胁迫0～15 d，野生型和ClNAC9-13株系叶片蒸腾速率(Tr)呈逐渐降低的变化趋势，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系叶片Tr值呈波动降低的变化趋势。干旱胁迫0 d，ClNAC9-13株系叶片Tr值最低，ClNAC9-6株系叶片Tr值最高，二者间差异显著；干旱胁迫5 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Tr值较干旱胁迫0 d不同程度降低；干旱胁迫10 d，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系叶片Tr值较干旱胁迫5 d略有回升，而野生型和ClNAC9-13株系叶片Tr值继续降低；干旱胁迫15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Tr值较干旱胁迫10 d明显降低，其中，3个转ClNAC9基因株系叶片Tr值显著高于野生型。

由表2还可见：干旱胁迫0～15 d，野生型叶片水分利用效率(WUE)呈逐渐降低的变化趋势，3个转ClNAC9基因株系叶片WUE值呈先升高后降低的变化趋势。干旱胁迫0 d，ClNAC9-13株系叶片WUE值最高，ClNAC9-6株系叶片WUE值最低，二者间差异显著；干旱胁迫5 d，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系叶片WUE值较干旱胁迫0 d明显升高，ClNAC9-13株系叶片WUE值略有升高，野生型叶片WUE值略有降低；干旱胁迫10 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片WUE值较干旱胁迫5 d不同程度降低，其中，ClNAC9-5株系的降幅最大；干旱胁迫15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片WUE值继续降低，其中，野生型叶片WUE值最低。

3个转ClNAC9基因株系叶片Pn、Gs、Tr和WUE值的降幅均小于野生型。总体上看，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系叶片的Pn、Gs和Tr值显著高于野生型和ClNAC9-13株系，且ClNAC9-5株系叶片的WUE值较高。

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 转ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

2.3 干旱胁迫下转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片叶绿素荧光参数的比较

2.3.1 叶片初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)和可变荧光(Fv)的比较 不同干旱胁迫时间转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片Fo、Fm和Fv值见表3。由表3可见：干旱胁迫0～15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Fo值均呈先降低后升高的变化趋势；野生型和ClNAC9-13株系叶片Fm和Fv值呈逐渐降低的变化趋势，ClNAC9-5株系叶片Fm和Fv值基本呈先降低后升高的变化趋势，ClNAC9-6株系叶片Fm和Fv值呈“降低—升高—降低”的变化趋势。干旱胁迫15 d，野生型叶片Fo值显著(P<0.05)高于3个转ClNAC9基因株系，而其叶片Fm和Fv值显著低于3个转ClNAC9基因株系。在整个干旱胁迫过程中，ClNAC9-6株系叶片Fm和Fv值总体上显著高于野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系；其叶片Fo值在干旱胁迫0～15 d总体上显著高于ClNAC9-5株系，而其叶片Fo值仅在干旱胁迫初期高于野生型和ClNAC9-13株系，在干旱胁迫后期明显低于野生型和ClNAC9-13株系。

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 转ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

2.3.2 叶片PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和PSⅡ潜在光化学活性(Fv/Fo)的比较 不同干旱胁迫时间转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片Fv/Fm和Fv/Fo值见表4。由表4可见：干旱胁迫0～15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Fv/Fm和Fv/Fo值均呈先升高后降低的变化趋势。干旱胁迫0 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Fv/Fm值在0.79左右，Fv/Fo值在3.9左右；干旱胁迫5 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Fv/Fm和Fv/Fo值较干旱胁迫0 d略有升高；干旱胁迫10 d，野生型和ClNAC9-13株系叶片Fv/Fm和Fv/Fo值较干旱胁迫5 d降低，而ClNAC9-5和ClNAC9-6株系叶片Fv/Fm和Fv/Fo值继续升高；干旱胁迫15 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片Fv/Fm和Fv/Fo值均较干旱胁迫10 d降低。总体上看，3个转ClNAC9基因株系叶片Fv/Fm和Fv/Fo值的降幅小于野生型。

2.3.3 叶片光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)的比较 不同干旱胁迫时间转ClNAC9基因露地菊品种‘纽9717’叶片qP和qN值见表5。由表5可见：干旱胁迫0～15 d，野生型叶片qP值呈逐渐降低的变化趋势，3个转ClNAC9基因株系叶片qP值呈先降低后升高的变化趋势。干旱胁迫0 d，ClNAC9-6株系叶片qP值较高，ClNAC9-5株系叶片qP值较低，野生型和ClNAC9-13株系叶片qP值居中；干旱胁迫5 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片qP值较干旱胁迫0 d不同程度降低，其中，ClNAC9-13株系的降幅较大；干旱胁迫10 d时，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片qP值继续降低，其中，野生型的降幅最大；干旱胁迫15 d，野生型叶片qP值继续降低，而3个转ClNAC9基因株系叶片qP值有所升高， 3个转ClNAC9基因株系叶片qP值显著高于野生型。

由表5还可见：干旱胁迫0～15 d，野生型叶片qN值呈先降低后升高的变化趋势，ClNAC9-5和ClNAC9-13株系叶片qN值呈逐渐升高的变化趋势，ClNAC9-6株系叶片qN值呈先升高后降低的变化趋势。干旱胁迫0 d，ClNAC9-6和ClNAC9-13株系叶片qN值较高；干旱胁迫5 d，野生型叶片qN值较干旱胁迫0 d略有降低，而3个转ClNAC9基因株系叶片qN值略有升高；干旱胁迫10 d，野生型和3个转ClNAC9基因株系叶片qN值较干旱胁迫5 d不同程度升高，其中，ClNAC9-6株系的升幅最大；干旱胁迫15 d，野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系叶片qN值较干旱胁迫10 d明显升高，而ClNAC9-6株系叶片qN值略有降低，3个转ClNAC9基因株系叶片qN值显著高于野生型。

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 转ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 转ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

3 讨 论

干旱胁迫影响植物的光合色素、光系统、电子传递系统以及CO2还原途径等，降低植物的整体光合能力[16]。植物具有一系列调控机制以增强对干旱胁迫的耐受性，主要包括增加扩散阻力、减少水分丧失、扩大根系吸收水分范围和效率以及降低叶片蒸腾损失[17]。干旱胁迫过程中，气孔导度(Gs)随叶片水势发生变化，一定程度上限制CO2进入叶片，并降低蒸腾作用，提高水分利用效率(WUE)，进而影响净光合速率(Pn)。已有研究结果表明：当植株受到干旱胁迫时，叶片的叶绿素含量、Gs值、Pn值、蒸腾速率(Tr)和干质量不同程度降低[18-19]，其中，叶绿素含量的降低导致叶片对光能的吸收能力下降，光能损失严重[20]。Tamirisa等[21]的研究结果表明：胁迫条件下，转基因植株表现出较高的光合速率。本研究结果显示：干旱胁迫过程中，露地菊品种‘纽9717’的野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系叶片Gs值呈先略有升高后逐渐降低的变化趋势，ClNAC9-6株系叶片Gs值呈逐渐降低的变化趋势，表明植株受到干旱胁迫时对气孔进行了有效调节，减少叶片水分散失；ClNAC9-5和ClNAC9-6株系叶片Tr值呈波动降低的变化趋势，野生型和ClNAC9-13株系叶片Tr值持续降低，其中野生型的降幅最大；野生型叶片Pn值持续降低，3个转ClNAC9基因株系叶片Pn值均先升高后降低，说明转基因植株在单位时间内同化有机物的能力更强；野生型叶片WUE值也持续降低，3个转ClNAC9基因株系叶片WUE值呈先升高后降低的变化趋势，其中，ClNAC9-6株系叶片WUE值的变化幅度较小，说明干旱胁迫下转ClNAC9基因株系叶片的保水能力和气体交换能力更强，在水分缺失时能够更有效地调控植株的光合能力。

光化学淬灭系数(qP)表示PSⅡ反应中心的开放程度，且直接体现捕获光子能量用于光化学反应能力。野生型叶片qP值在整个干旱胁迫过程中持续降低，表明PSⅡ反应中心大幅度关闭，3个转ClNAC9基因株系叶片qP值在干旱胁迫0～10 d持续降低后在干旱胁迫15 d升高，说明转ClNAC9基因株系在干旱胁迫15 d有效调控了能量传递[26]。非光化学淬灭系数(qN)升高，表明叶片以热耗散的方式消耗过剩激发能，从而保护光合机构免遭光破坏[27]。Zhou等[28]认为，干旱胁迫下番茄(LycopersiconesculentumMill.)叶片qN值降低。Mathobo等[29]研究认为，干旱胁迫下菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)叶片qP和qN值总体上呈升高的趋势。本研究中，野生型叶片qN值呈先降低后升高的变化趋势，3个转ClNAC9基因株系叶片qN值总体上呈升高的变化趋势，表明在干旱胁迫过程中转ClNAC9基因株系能通过热耗散的方式来保护光合器官的能力较佳。

综合研究结果显示：干旱胁迫下转ClNAC9基因使露地菊品种‘纽9717’叶片的Pn和WUE值升高，PSⅡ反应中心的开放程度和最大光化学效率增大，PSⅡ反应中心的受损程度减小，光系统的保护机制增强，从而增强了露地菊的抗旱性。其中，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系对干旱胁迫的耐受性较强，ClNAC9-13株系对干旱胁迫的耐受性较弱，但均强于野生型。