中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉颜色形成的分子机制

张计育， 潘德林， 贾展慧， 王 刚， 王 涛， 翟 敏， 郭忠仁

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)， 江苏 南京 210014〕

猕猴桃(Actinidiaspp.)种质资源极其丰富，果肉颜色变异丰富[1]，包括浅绿色、深绿色、黄色、橙色、红色和紫色等[2]。目前世界上主要栽培的中华猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)品种有‘Hort16A’和‘红阳’(‘Hongyang’)，二者果肉颜色均为黄色。猕猴桃果肉颜色主要取决于猕猴桃果实中叶绿素、类胡萝卜素和花青素的含量，在果实生长、成熟和软化过程中，叶绿素、类胡萝卜素和花青素等色素的含量不断变化[2]。黄肉中华猕猴桃果实发育早期果实中主要含叶绿素和类胡萝卜素，随着果实发育、成熟和软化，叶绿素降解，而保留原有的类胡萝卜素，果肉颜色变为黄色[2]。研究猕猴桃果肉颜色以及色素的代谢和表达调控对于培育彩色猕猴桃新种质具有重要意义。已有研究者对猕猴桃果肉中部分叶绿素和类胡萝卜素的生物合成和降解相关基因的表达调控进行了分析[3-4]。而有关叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解通路的所有基因尚未进行全面系统的研究和分析。Huang等[5]完成了中华猕猴桃品种‘红阳’的全基因组测序，为系统研究猕猴桃果肉颜色形成的分子调控机制奠定了基础。

中华猕猴桃品种‘Hort16A’为黄肉中华猕猴桃品种之一。作者已对该品种在南京地区的生物学特性和果实发育规律进行了研究[6]。在此基础上，本研究对中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实发育的动态变化进行了观察，并选择采后贮藏过程中果肉颜色变化的关键节点分析叶绿素和类胡萝卜素含量以及叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因的表达特性，以期阐明中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉颜色形成的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

供试中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采自江苏省中国科学院植物研究所南京六合基地。于2016年4月22日至9月7日(花后2～140 d)，随机选取5株样株，每株采集5个无病虫害且大小基本一致的果实，每7 d采集1次，并拍照记录。并于9月7日采收所有果实，置于(23±2) ℃恒温箱中，每天观察果肉颜色，根据果肉颜色的变化差异拍照和取样。每次取10个果实，重复3次。

1.2 方法

1.2.1 叶绿素和类胡萝卜素含量测定 称取果肉混合样品约5 g，参考李合生[7]的方法测定果肉中叶绿素和类胡萝卜素的含量。然后根据公式“类胡萝卜素/叶绿素比=类胡萝卜素含量/叶绿素含量”计算类胡萝卜素/叶绿素比。每次取10个果实，重复测定3次。

1.2.2 基因表达特性分析 根据已报道的中华猕猴桃‘红阳’基因组数据库中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因的序列(http：∥bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)，利用Beacon Designer 7.0软件设计引物(表1)，引物由北京擎科新业生物科技有限公司合成。内参基因为猕猴桃Actin基因[8]，引物为Actin-F

(5′-T￣G￣C￣A￣T￣G￣A￣G￣C￣G￣A￣T

C￣A￣A￣G￣T￣T￣T￣C￣A￣A￣G-3′) 和Actin-R (5′-T￣G￣T￣C￣C￣C￣A￣T￣G￣T

C￣T￣G￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣G￣A￣C￣T-3′)。

采用改良的CTAB法[9]提取果肉中的总RNA，利用能消除RNA中残留DNA的反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)〔宝生物工程(大连)有限公司〕合成cDNA，具体操作参照说明书。实时荧光定量PCR反应参考文献[10]的方法。反应体系包含10倍稀释cDNA 1.0 μL、0.15 nmol·L-1上游引物和下游引物以及SYBR®PremixExTaqTM〔宝生物工程(大连)有限公司〕10.0 μL，ddH2O 补足至20.0 μL。反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性20 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，40个循环。每个样品3次重复，根据2-ΔΔCT计算各基因的相对表达量[11]。

表1用于中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因PCR扩增的引物序列

Table1PrimersequencesusedforPCRamplificationofbiosynthesisanddegradationrelatedgenesofchlorophyllandcarotenoidfromfruitofActinidiachinensis‘Hort16A’

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0软件处理数据，采用Duncan’s新复极差法进行显著性检验。实时荧光定量PCR数据采用MeV 4.9.0软件绘制热图。对叶绿素和类胡萝卜素含量与其生物合成和降解相关基因相对表达量间以及叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因相对表达量间进行皮尔森相关性分析。

2 结果和分析

2.1 果实发育动态变化分析

中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实发育动态变化见图1。由图1可见：花后2～140 d，中华猕猴桃品种‘Hort16A’的果肉为绿色，其中，花后58 d，果实中种子开始变白；花后79 d，种子为浅棕色；花后93 d，种子开始变黑。花后140 d采收后，随着果实的成熟和软化，果肉颜色逐渐变黄。

1-25： 分别为花后2、9、16、23、30、37、44、51、58、65、72、79、86、93、100、107、114、121、128、135和140 d以及采后7、12、14和16 d的果实横切面Transverse section of fruit at 2， 9， 16， 23， 30， 37， 44， 51， 58， 65， 72， 79， 86， 93， 100， 107， 114， 121， 128， 135， and 140 d after flowering， and 7， 12， 14， and 16 d after harvesting， respectively.图1 中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实发育动态变化Fig. 1 Dynamic change of fruit development of Actinidia chinensis ‘Hort16A’

2.2 果实采后果肉中叶绿素和类胡萝卜素含量的动态变化分析

根据中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉颜色的变化情况(图1)，对采后7、12、14和16 d果肉中叶绿素和类胡萝卜素含量分别进行了测定。结果(表2)表明：采后7～16 d，中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉中叶绿素含量呈先升高后降低的变化趋势，采后16 d(果肉完全变成黄色)，果肉中叶绿素含量显著降低；采后12～16 d，果肉中类胡萝卜素含量较采后7 d升高，但差异未达到显著水平；而果肉中类胡萝卜素/叶绿素比呈逐渐升高的变化趋势，且在采后16 d显著升高。

采后天数/dDays after harvesting色素含量/(mg·kg-1)Pigment content叶绿素Chlorophyll类胡萝卜素Carotenoid类胡萝卜素/叶绿素比Carotenoid/chlorophyll ratio70.094±0.012a0.028±0.006a0.303±0.073b120.135±0.017a0.043±0.007a0.327±0.067b140.140±0.017a0.052±0.010a0.375±0.089b160.024±0.007b0.045±0.013a2.029±0.850a

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2.3 果实采后果肉中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因的表达特性分析

中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素生物合成相关基因CAO1、GluTR1、LHCB1、LHCB2、RBCS1、CBR1、CLH1、CLH2和CLS1，叶绿素降解相关基因PAO1、PAO2、PPH1、PPH2、PPH3、SGR1和SGR2，类胡萝卜素生物合成相关基因PSY1、PSY2、CrtISO1、PTOX1、ZDS1、ZISO1、PDS1、LCYB1、LCYB2、LCYE1、CYP1、CYP2和CHY1以及类胡萝卜素降解相关基因NCED1、NCED2、ZEP1、VDE1、VDE2、CCD1和CCD2的表达特性见图2。

2.3.1 叶绿素生物合成和降解相关基因的表达特性分析 由图2-A可见：采后12 d叶绿素生物合成相关基因中CAO1、GluTR1、LHCB1、LHCB2、CBR1和CLH1基因的相对表达量较采后7 d的相对表达量显著升高，之后显著降低；采后7～16 d，RBCS1和CLS1基因的相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势；采后7～16 d，CLH2基因的相对表达量无显著变化。

由图2-B可见：采后7～16 d，叶绿素降解相关基因中PAO2、PPH2和PPH3基因的相对表达量呈先显著升高后降低的变化趋势；PAO1、PPH1和SGR2基因的相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势；采后16 d，SGR1基因的相对表达量显著升高。总体上看，PAO1、PPH1、PPH2、SGR1和SGR2基因在采后16 d的相对表达量显著高于采后7 d的相对表达量。

2.3.2 类胡萝卜素生物合成和降解相关基因的表达特性分析 由图2-C可见：采后7～16 d，类胡萝卜素生物合成相关基因中CrtISO1、ZISO1和LCYB1基因的相对表达量呈先升高后降低的变化趋势；CYP1和CHY1基因的相对表达量呈逐渐升高的变化趋势；LCYB2基因的相对表达量显著升高；CYP2基因的相对表达量在采后16 d显著升高；LCYE1基因的相对表达量则呈先升高后降低再升高的变化趋势；PSY1、PSY2、ZDS1和PDS1基因的相对表达量无显著变化；PTOX1基因的相对表达量呈逐渐降低的变化趋势。总体上看，CrtISO1、ZISO1、LCYB2、CYP1和CHY1基因在采后12～16 d的相对表达量显著高于采后7 d的相对表达量。

由图2-D可见：采后7～16 d，类胡萝卜素降解相关基因中NCED1、NCED2、ZEP1和CCD2基因的相对表达量显著升高，VDE1基因的相对表达量呈先升高后显著降低再升高的变化趋势，VDE2基因的相对表达量呈先降低后升高的变化趋势，CCD1基因的相对表达量呈先升高后显著降低的变化趋势。

2.4 相关性分析

中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素和类胡萝卜素含量与其生物合成和降解相关基因相对表达量间的相关性分析分别见表3和表4。结果表明：中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素含量与叶绿素降解相关基因中PAO2基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，与叶绿素降解相关基因中SGR1基因的相对表达量在0.05水平上显著负相关。果肉中类胡萝卜素含量与类胡萝卜素生物合成相关基因中LCYB2和CYP1基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关。

D1，D2，D3，D4： 分别为采后7、12、14和16 d Representing 7， 12， 14， and 16 d after harvesting， respectively.A： 叶绿素生物合成相关基因Chlorophyll biosynthesis related genes； B： 叶绿素降解相关基因Chlorophyll degradation related genes； C： 类胡萝卜素生物合成相关基因Carotenoid biosynthesis related genes； D： 类胡萝卜素降解相关基因Carotenoid degradation related genes.图2 中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因的表达特性Fig. 2 Expression characteristics of biosynthesis and degradation related genes of chlorophyll and carotenoid from flesh of postharvest fruit of Actinidia chinensis ‘Hort16A’

中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因相对表达量间的相关性分析分别见表5和表6。结果显示：中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因中个别基因相对表达量间在0.05或0.01水平上显著相关。其中，叶绿素生物合成和降解相关基因中，CAO1基因的相对表达量与GluTR1、LHCB1、LHCB2、CLH1和PPH3基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，RBCS1基因的相对表达量与CLH2、PAO1和SGR2基因的相对表达量在0.05或0.01水平上显著正相关，PAO1基因的相对表达量还与CLH2、PPH1和SGR2基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，SGR1基因的相对表达量与SGR2基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，PAO2基因的相对表达量与其他叶绿素生物合成和降解相关基因的相对表达量的相关性均不显著。类胡萝卜素生物合成和降解相关基因中，PSY1基因的相对表达量与PDS1基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，PSY2基因的相对表达量与CrtISO1、ZISO1、LCYB2、NCED2和ZEP1基因的相对表达量在0.05或0.01水平上显著正相关，ZDS1基因的相对表达量与PDS1、LCYE1和NCED1基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，PDS1基因的相对表达量还与NCED1基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，LCYB1基因的相对表达量与LCYE1和NCED2基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，LCYB2基因的相对表达量还与CrtISO1和ZISO1基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，CYP1基因的相对表达量与其他类胡萝卜素生物合成和降解相关基因的相对表达量的相关性均不显著。

表3中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素含量与叶绿素生物合成和降解相关基因相对表达量间的相关性分析

Table3AnalysisoncorrelationbetweenchlorophyllcontentandrelativeexpressionlevelsofchlorophyllbiosynthesisanddegradationrelatedgenesfromfleshofpostharvestfruitofActinidiachinensis‘Hort16A’

指标Index与不同基因相对表达量的相关系数1) Correlation coefficient with relative expression levels of different genes1)CAO1GluTR1LHCB1LHCB2RBCS1CBR1CLH1CLH2叶绿素含量Chlorophyll content0.3500.0720.4740.440-0.7630.4830.146-0.655指标Index与不同基因相对表达量的相关系数1) Correlation coefficient with relative expression levels of different genes1)CLS1PAO1PAO2PPH1PPH2PPH3SGR1SGR2叶绿素含量Chlorophyll content-0.180-0.7440.908*-0.3880.0920.535-0.972*-0.865

1)*： 表示在0.05水平上显著相关 Indicating the significant correlation at 0.05 level.

表4中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中类胡萝卜素含量与类胡萝卜素生物合成和降解相关基因相对表达量间的相关性分析

Table4AnalysisoncorrelationbetweencarotenoidcontentandrelativeexpressionlevelsofcarotenoidbiosynthesisanddegradationrelatedgenesfromfleshofpostharvestfruitofActinidiachinensis‘Hort16A’

指标Index与不同基因相对表达量的相关系数1) Correlation coefficient with relative expression levels of different genes1)PSY1PSY2CrtISO1PTOX1ZDS1ZISO1PDS1LCYB1LCYB2LCYE1类胡萝卜素含量Carotenoid con-tent-0.0650.7670.828-0.4520.3350.8230.2350.1500.940*0.194指标Index与不同基因相对表达量的相关系数1) Correlation coefficient with relative expression levels of different genes1)CYP1CYP2CHY1NCED1NCED2ZEP1VDE1VDE2CCD1CCD2类胡萝卜素含量Carotenoid con-tent0.925*0.1060.6230.5490.4670.679-0.2850.151-0.3280.390

1)*： 表示在0.05水平上显著相关Indicating the significant correlation at 0.05 level.

表5中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中叶绿素生物合成和降解相关基因相对表达量间的相关性分析

Table5AnalysisoncorrelationamongrelativeexpressionlevelsofchlorophyllbiosynthesisanddegradationrelatedgenesfromfleshofpostharvestfruitofActinidiachinensis‘Hort16A’

相对表达量Relative expression level不同基因相对表达量间的相关系数1) Correlation coefficient among relative expression levels of different genes1)CAO1GluTR1LHCB1LHCB2RBCS1CBR1CLH1CLH2CAO11.000GluTR10.959*1.000LHCB10.920*0.8511.000LHCB20.964*0.903*0.991**1.000RBCS10.2140.440-0.0900.0121.000CBR10.7980.7280.970*0.930*-0.2441.000CLH10.978*0.997**0.8690.922*0.3920.7401.000CLH20.4750.6990.2680.3440.915*0.1480.6471.000CLS10.8030.8950.5400.6390.7450.3470.8860.841PAO10.3080.5390.0350.1280.989**-0.1100.4880.964*PAO20.6370.3940.6170.634-0.4220.5290.467-0.321PPH10.6360.7750.3310.4400.8810.1330.7540.903*PPH20.7790.7760.4720.5840.5730.2440.7960.583PPH30.978*0.8800.933*0.965*0.0260.8240.914*0.284SGR1-0.340-0.080-0.550-0.4850.834-0.602-0.1450.654SGR20.0260.272-0.260-0.1650.981**-0.3830.2170.857相对表达量Relative expression level不同基因相对表达量间的相关系数1) Correlation coefficient among relative expression levels of different genes1)CLS1PAO1PAO2PPH1PPH2PPH3SGR1SGR2CAO1GluTR1LHCB1LHCB2RBCS1CBR1CLH1CLH2CLS11.000PAO10.7911.000PAO20.229-0.4001.000PPH10.970*0.904*0.0291.000PPH20.918*0.5830.5010.8681.000PPH30.6840.1150.7740.4890.7241.000SGR10.2570.789-0.8240.4750.052-0.5201.000SGR20.6020.957*-0.5780.7730.414-0.1660.925*1.000

1)*： 表示在0.05水平上显著相关Indicating the significant correlation at 0.05 level； ** ： 表示在0.01水平上显著相关Indicating the significant correlation at 0.01 level.

表6中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后果肉中类胡萝卜素生物合成和降解相关基因相对表达量间的相关性分析

Table6AnalysisoncorrelationamongrelativeexpressionlevelsofcarotenoidbiosynthesisanddegradationrelatedgenesfromfleshofpostharvestfruitofActinidiachinensis‘Hort16A’

1)*： 表示在0.05水平上显著相关Indicating the significant correlation at 0.05 level； ** ： 表示在0.01水平上显著相关Indicating the significant correlation at 0.01 level.

3 讨论和结论

猕猴桃果实发育早期，果肉颜色为绿色。随着果实发育，黄肉猕猴桃果肉色度显著降低，变为黄色，而绿肉猕猴桃果肉仍呈绿色，色度变化较小[3]。中华猕猴桃品种‘金丰’(‘Jinfeng’)在花后130～140 d，色度迅速降低，果实变软，可溶性固形物含量增加，果肉颜色由绿变黄[12]。叶绿素和类胡萝卜素是黄肉猕猴桃果实中的主要色素，其含量决定了果肉颜色[2]。黄肉猕猴桃果实成熟和软化过程中，果肉中的叶绿素降解成无色的叶绿素中间产物，剩下黄色的类胡萝卜素[4]。中华猕猴桃品种‘Hort16A’在果实采后成熟和软化过程中，果肉逐渐变黄，叶绿素含量先升高后显著降低，类胡萝卜素含量有所升高但无显著变化，说明其果肉中叶绿素含量降低是果肉变黄的主要原因。

叶绿素代谢分为叶绿素生物合成、叶绿素循环和叶绿素降解3个阶段[13]。Pilkington等[3]研究认为，叶绿素生物合成相关基因中RBCS和CAO基因在黄肉猕猴桃中相对表达量的降低导致叶绿素生物合成下降。叶绿素降解相关基因中PAO基因编码的蛋白质可以催化脱镁叶绿素a为叶绿素分解物，使果肉中绿色减少[14]，该基因在黄肉中华猕猴桃和绿肉美味猕猴桃〔Actinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev.) A. Chev.〕中均表达，但是在黄肉猕猴桃果实发育阶段其相对表达量更高，是叶绿素降解的关键基因。SGR基因同样也是叶绿素降解的关键基因，可以通过激发PPH、PAO和RCCR等多个叶绿素降解酶(chlorophyll catabolic enzymes，CCEs)和捕光复合物Ⅱ(light-harvesting complex Ⅱ，LHCⅡ)相互作用，形成SGR-CCE-LHCⅡ复合体，从而促使叶绿素从LHCⅡ上解离，进入降解途径[15]。本研究中，中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉中叶绿素含量与PAO2基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，与SGR1基因的相对表达量在0.05水平上显著负相关，与上述研究结果存在异同，具体原因需进行进一步研究。本研究中，中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉中CAO1、GluTR1、LHCB1、LHCB2、CBR1和CLH1 6个叶绿素生物合成相关基因的相对表达量随着叶绿素的降解显著降低，而PAO1、PAO2、PPH1、PPH2、PPH3、SGR1和SGR2 7个叶绿素降解相关基因在果实采后12～16 d的相对表达量总体上显著高于采后7 d的相对表达量，推测这是造成果肉中叶绿素含量降低的原因。

类胡萝卜素在植物果实中积累，可以使果实呈现黄色、橙色或红色[16]。植物体内类胡萝卜素的生物合成途径在物种间相对保守[17-19]。但类胡萝卜素生物合成的调控机制在不同物种间存在差异。辣椒(CapsicumannuumLinn.)中PSY和PDS基因的相对表达量高，类胡萝卜素含量高[20]。甜橙〔Citrussinensis(Linn.) Osbeck〕中PDS基因的相对表达量与类胡萝卜素含量正相关[21]。大籽猕猴桃(ActinidiamacrospermaC. F. Liang)中PSY、ZDS和LCYB等基因的相对表达量升高，类胡萝卜素含量升高[4]。大籽猕猴桃和黑蕊猕猴桃(ActinidiamelanandraFranch.)杂交后代中，随着果实发育进程类胡萝卜素含量升高，同时LCYB基因的相对表达量升高，并且在高类胡萝卜素含量或低类胡萝卜素含量基因型中相对表达量差异大，说明LCYB基因在类胡萝卜素的积累过程中起着非常重要的作用[4]。本研究中，中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉中类胡萝卜素含量与LCYB2基因的相对表达量在0.05水平上显著正相关，与上述研究结果一致。在采后7～16 d，中华猕猴桃品种‘Hort16A’果肉颜色逐渐变黄，类胡萝卜素含量升高但无显著变化，而类胡萝卜素生物合成相关基因中CrtISO1、ZISO1、LCYB2、CYP1和CHY1基因的相对表达量以及类胡萝卜素降解相关基因中NCED1、NCED2、ZEP1和CCD2基因的相对表达量均显著升高，说明可能是类胡萝卜素生物合成和降解达到了平衡。

综上所述，中华猕猴桃品种‘Hort16A’果实采后贮藏过程中，果肉中叶绿素生物合成减少和叶绿素降解增加导致叶绿素含量降低，是果肉变黄的主要原因。建议选择猕猴桃果肉中叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解中的关键基因进行功能分析，并对其调控机制进行深入研究。此外，叶绿素和类胡萝卜素生物合成和降解相关基因中个别基因的相对表达量间存在显著相关性，而这些基因间的联系尚未见报道，需要通过进一步的实验进行验证。