马齿苋多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠组织IL-6/STAT3及NF-κB的影响*

范文涛， 王攀红， 王 倩

(陕西中医药大学， 咸阳 712046)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)发病高峰在成年早期，易反复发作形成长期性慢性疾病，其中10%～15%的患者可发展成为结直肠癌(carcinoma of colon and rectum，CRC)。病理学研究在大多数肿瘤组织中发现了炎症因子，说明炎性因子刺激了肿瘤的发生。研究发现，炎症和肿瘤的发生具有相同的信号通路及靶点，为炎症转化为肿瘤提供了共同的作用机制。因此，治疗慢性炎症可能是防止炎症性肠病癌变的有效手段。

马齿苋(Portulaca oleracea L.)富含多糖、黄酮、生物碱、有机酸、多种维生素和微量元素等多种化学成分。临床实验研究发现，马齿苋有效成分具有保护神经、抗糖尿病、抗氧化、抑制细菌生长、抗溃疡、抗癌等多种药理效应。本文探讨马齿苋多糖对溃疡性结肠炎IL6/STAT3及NF-κB的调控作用，以明确IL-6/STAT3信号通路与慢性炎症性肠病发病的关系，为慢性溃疡性结肠炎的治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 动物和主要试剂

清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重(180±20) g，购自西安交通大学实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2012-003。

美沙拉嗪缓释颗粒剂(法国爱的发制药技术公司，批号：20110816)；IL-6 放免试剂盒(上海瑞齐生物科技有限公司)；MaxVision TM即用型试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)；2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid sol，TNBS)(Sigma公司)；抗髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)单克隆抗体(上海倍卓生物科技有限公司)；IL-6/STAT3试剂盒(上海研鑫生物科技有限公司)；sIL-6Rα/gp 130 ELISA试剂盒(上海沪宇生物科技有限公司)。

取马齿苋干品用无水乙醇、丙酮、乙醚试剂回流提取。离心，沉淀用无水乙醇脱水2次，返溶冻干，冻干品为粗多糖。取粗多糖溶于超滤水中，滤液过层析柱，洗脱液经8 kD膜包超滤，收集循环液，冻干品为精品多糖；同时收集滤过液，浓缩冻干，为小分子对照品。马齿苋精品多糖为无定形粉末，不溶于高浓度乙醇和丙酮，Molish反应和蒽酮硫酸反应阳性，证明该粉末中含多糖；本品用蒽酮—硫酸比色法检测多糖含量，为 82%～93%；取本品1%水溶液1 ml，加新配制的30%磺基水杨酸1 ml，混合放置5 min，未检出蛋白质。

1.2 复制TNBS诱导结肠炎的大鼠模型

大鼠空腹24 h，麻醉后将30 mg TNBS加入0.3 ml 40%无水乙醇中，注入大鼠结肠，待药物被肠道充分吸收后，将大鼠放回笼中饲养，自由饮水和饮食。对照组大鼠以等体积0.9% Nacl溶液灌肠，其他条件与模型组相同。

1.3 动物分组与处理

将复制成功的模型大鼠随机分为3组，即模型组、美沙拉嗪组和马齿苋组(n=10)。造模成功后第3天开始灌胃给药：美沙拉嗪组剂量为每次10 mg/kg，每日1次，连续3周；马齿苋组给予马齿苋多糖，每次10 ml/kg，每日1次，连续3周；模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续3周。另取10只清洁级SD大鼠为对照组，给予正常饮食，同时给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续3周。

1.4 标本取材

治疗结束后大鼠禁食(不禁水)24 h,。用代谢笼分别收集每只大鼠24 h的粪便，观察粪便形态，称重，烘干后再次称重，计算含水量。麻醉后抽取腹主动脉血约5 ml，离心，分离血清置EP管中-80 ℃冰箱保存。采血后立即清理出大鼠结肠，检查结肠内容物形态，采集结肠组织，经肠系膜边缘剪开肠腔，清洗，观察结肠表面水肿及溃疡情况，测量其面积。选取病变最明显处约1 cm2结肠的组织，立即将每块组织与0.5 ml RNA holder一起置液氮中速冻，然后转移至-80 ℃冰箱冷冻保存。各组大鼠分别采若干病变最显著处的结肠组织，置10%甲醛中固定24 h，用于作病理切片。

1.5 结肠组织病理评分标准

参考结肠病理组织学评分标准，由3位病理专业人员进行双盲评分，取平均值。(1)炎细胞浸润：无为0分，轻度1分，重度2分；(2)浸润深度：黏膜层1分，黏膜和黏膜下层2分，结肠全层3分；(3)溃疡深度：无0分，上皮1分，黏膜固有层2分，黏膜至肌层3分。

1.6 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB含量的变化

血清IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB检测用ELISA试剂盒购自北京晶美科技有限公司。腹主动脉取血，静置后离心分离血清，严格按试剂盒说明书操作。

1.7 免疫组化染色法测定结肠MPO

快捷免疫组化染色法(Max vision，TM)测定结肠髓过氧化酶(myeloperoxidase，MPO)，具体实验按试剂盒说明书进行。

1.8 RT-PCR方法检测STAT3、IL-6 mRNA

按照Trizol试剂盒说明书提取各组结肠组织的总RNA；按照RT-PCR试剂盒说明书，以Oligo (dT)为引物，将RNA逆转录为cDNA，逆转录条件：95 ℃ 5 min，30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，以β-actin为内参。实时荧光定量PCR检测STAT3，IL-6 mRNA的表达。

1.9 Western blot实验

提取并分离各组大鼠结肠组织蛋白，将分离后的蛋白转移至硝酸纤维膜上，封闭转移膜，分别加入一抗(抗HDACI多克隆抗体以及抗β-actin单克隆抗体)反应过夜，随后加入二抗反应2 h，暗室发光显影。以Quantity one v462图像分析软件对图像进行分析，以目的条带与β-actin灰度值的比值作为蛋白表达相对含量。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠粪便性状的改变

大便性状采用布里斯托评分法(Bristol grading score)，大便含水量采用粪便含水率测定(fecal moisture content)。对照组大鼠的粪便呈褐色椭圆球状颗粒，无粘连，气味酸臭。模型组大鼠粪便呈黑褐色糊状，气味酸臭；美沙拉嗪组大鼠粪便呈褐色椭圆球状松软颗粒，部分存在粘连，气味酸臭；马齿苋组大鼠的粪便呈褐色椭圆球状颗粒，无粘连，气味酸臭。布里斯托大便评分及大便含水率见表1。

Tab. 1 The feces characters by Bristol scoring and the content of fecal moisture of rats in each

*P<0.05，**P<0.01vsbefore treatment；#P<0.05，##P<0.01vscontrol group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01vsmodel group

2.2 大鼠结肠粘膜的变化

对照组大鼠结肠粘膜表面光滑，纹理清晰。模型组大鼠病变处肠组织显著增厚，粘膜充血伴有水肿、糜烂及溃疡。美沙拉嗪组、马齿苋组大鼠的肠壁增厚程度、粘膜充血水肿及糜烂、溃疡等情况均较模型组减轻，美沙拉嗪组和马齿苋组大鼠结肠肠黏膜下水肿面积和溃疡面积无统计学差异(P>0.05)。

各组结肠黏膜下水肿面积和溃疡面积的测定见表2。

GroupThe whole colon edema areaThe whole colon ulcer areaControl 0 0Model71.52±16.856.52±1.35Purslane42.38±19.72**3.36±1.52**Mesalazine48.52±14.69*4.28±1.49**

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

2.3 大鼠结肠组织病理学及大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量的变化

对照组大鼠结肠组织腺体形态完整，各层未见明显炎症浸润；模型组大鼠结肠组织腺体完整形态基本消失，仅有大小不等的腺泡样结构存在，炎细胞浸润明显，深达肌层；马齿苋组和美沙拉嗪组大鼠结肠组织腺体形态部分存在，腺体大小基本一致，局部炎细胞浸润。各组大鼠结肠组织病理形态学变化如图1所示，病理学评分结果见表3。与对照组比较，模型组大鼠血清中IL-1β，IL-6、TNF-α、sIL-6Rα、gp130含量明显增高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，马齿苋组和美沙拉嗪组大鼠血清中IL-1β，IL-6、TNF-α、sIL-6Rα、gp130含量明显减少(P<0.01，表3)。

2.4 大鼠结肠组织MPO、NF-κB、STAT3、IL-6 mRNA表达的变化

与对照组比较，模型组大鼠MPO、NF-κB、STAT3、IL-6 mRNA表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，马齿苋组、美沙拉嗪组大鼠MPO、NF-κB、STAT3、IL-6 mRNA表达明显降低(P<0.01，表4)。

Fig.1The pathological changes of colon in each group(HE ×200)

A: Control; B: Model; C: Purslane; D: Mesalazine

Tab. 3 The pathological changes of the rat colon tissues by HE staining db2d8dbd2255a13801323ac" class="figure_inparagraph" src="images/d9fedc114db2d8dbd2255a13801323ac0.jpg" width="75" height="11" title="width=75,height=11,dpi=110" alt="复杂单元:FZ" />

IL-1β: Interleukin 1β； IL-6: Interleukin-6； TNF-α: Tumor necrosis factor-α

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Tab. 4 The mRNA expression of MPO, NF-κB, STAT3, IL-6 in colon tissues of each group

MPO: Myeloperoxidase; NF-κB: Nuclear transcription factor-kappa B; STAT3: Signal transduction and transcriptional activator

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

2.5 Western blot测定结果的变化

与模型组比较，马齿苋多糖能明显下调STAT3蛋白表达量，进一步的p-STAT3分析显示，马齿苋组STAT3通道的活性状态也受到明显抑制。伴随这一效应，马齿苋组IL-6蛋白表达水平也较模型组降低(P<0.05)。说明马齿苋多糖抑制IL-6释放产生的后续效应，即对IL-6—JAK-STAT3信号通路中的信号传递系统呈现下调效应(图3)。

Fig.3The protein levels of STAT3 and IL-6 in colon tissues determined by Western blot

PP: Purslane polysaccharide

3 讨论

溃疡性结肠炎临床发病较高，可见于任何年龄，以 20～30岁最多。目前病因仍不清，研究发现与炎症、免疫、精神有关。既往研究多从基因层面、免疫机制、局部微环境、肠道菌群状态等方面进行了研究。对于溃疡性结肠炎发病机制的认识不仅包括先天基因易感性和适应性免疫，也包括基因之间的相互作用，微生物和环境因素也起着重要作用[1]。在溃疡性结肠炎的炎症反应中，组织中的促炎因子通过增加炎性细胞数量自身致炎，炎性细胞被反复激活并不断分泌促炎因子，形成负反馈调节，肠道炎性反应周而复始，组织损伤不断加重[2]。尤其是IL6与STAT3信号通路与本病有重要联系，阻断这一信号通路对本病的进展有明显影响[3，4]。因此，使用干预该信号通路特异性较强、不良反应较少的药物治疗，成为该病治疗的新思路[5]。

IL-6是一种由T细胞及巨噬细胞分泌具有促炎及抗炎作用的白细胞介素，能促进免疫反应。IL-6与靶细胞表面sIL-6R识别并结合，形成 sIL-6R/IL-6复合物，进一步活化细胞膜表面的gp130，gp130受到刺激形成同源二聚体，此时才能激活与gp130相关联的JAK使酪氨酸激酶活化，并与STAT3结合，这种激酶级联使STAT3磷酸化，激活NF-κB信号通路，转录因子NF-κB从细胞质进入细胞核内，调控炎性细胞因子的表达[6]。

中药马齿苋具有清热解毒，凉血止血的功效。马齿苋多糖具有抗菌、抗癌、营养神经、降糖、抗氧化的作用。前期研究发现马齿苋多糖能够调控慢性炎性病变局部炎性因子表达、Janus激酶-信号转导通路、丝裂原活化蛋白激酶通路、NF-κ B信号转导[7]。

本实验发现，马齿苋多糖对大鼠的一般活动，日常进食，排便等方面的改善都很明显。实验分别从病变组织与周围组织粘连情况，溃疡面积，肠壁厚度3方面，对结肠局部病变组织学的改善情况进行评估。结果提示，马齿苋组大鼠结肠病理状态明显改善，与模型组比较有明显差异。实验中使用的TNBS导致慢性结肠炎大鼠模型血清IL-6含量明显增高，其机制是乙醇破坏肠黏膜屏障, TNBS渗入结肠黏膜组织与大分子物质结合形成全抗原，引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应。实验结果表明马齿苋多糖能够明显降低慢性结肠炎大鼠模型血清IL-6及MPO的含量，提示马齿苋多糖对溃疡性结肠炎的疗效是明确的。在马齿苋多糖的干预下，不仅IL-6表达减少，血清中sIL-6Rα和gp130的表达量也下调，说明马齿苋多糖不仅抑制IL-6的释放，也抑制IL-6与其受体的结合过程。马齿苋多糖明显下调STAT3表达，马齿苋组大鼠STAT3通道活性也受到明显抑制，伴随这一效应IL-6 mRNA表达也较对照组降低。

这一结果说明，马齿苋多糖抑制IL-6的释放产生的后续效应，即对IL-6—JAK-STAT3信号通路中的信号传递系统呈现下调效应，该信号通路活化功能的下调使IL-6释放进一步减少，对溃疡性结肠炎病变局部微环境的改善起到积极作用[8]。这一点对炎症性肠病的治疗、症状的改善和长期预后甚至抑制癌变都是至关重要的。