苹果多酚通过下调钙敏感受体改善大鼠低氧性肺动脉高压的作用*

孟涵燕， 赵 洁， 花春艳， 朱星谕， 李依玲， 袁琳波△

(1. 温州医科大学第一临床医学院， 2. 温州医科大学基础医学院生理教研室， 浙江温州 325000)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一类以肺动脉压力进行性升高为特征的心肺血管疾病，是慢性肺源性心脏病、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺栓塞、睡眠呼吸暂停综合征(sleep apnea syndrome,SAS)等多种心肺疾病的重要病理生理环节，在临床上表现为肺动脉阻力持续性升高，导致右心室肥厚、扩张乃至右心衰竭，是当今最重要的国际性医疗问题之一[1,2]。

目前，治疗肺动脉高压的措施主要包括吸氧、利尿、扩张肺血管等，常用药物有前列环素及其衍生物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、钙离子拮抗剂等。这些药物可在一定程度上缓解肺动脉高压的症状，减慢肺血管重构的进程，但不能根治肺动脉高压，而且这些药物靶向性低、吸收率差，存在较多的副作用，治疗效果并不理想[3,4]。

苹果多酚是一种具有强抗炎、抗氧化生物活性的天然化合物，来源广泛，毒副作用小。第一，苹果多酚作为一种氧化还原电位很低的还原剂，能清除多种活性氧，减少氧自由基的生成；第二，可减弱金属离子对氧化还原反应的催化作用，抑制氧化酶活性，间接清除自由基；第三，抑制受到抗原刺激的肥大细胞释放组胺，抑制透明质酸酶活性，有效抑制机体的炎症反应[5]。现阶段我国对苹果多酚的开发利用尚处于初始阶段，且主要应用于食物的抗氧化保存、美容养颜等领域，医药方面的功能性研究仍然有很大的扩展空间。将水果中的天然成分——苹果多酚用于肺动脉高压的预防，具有较大的意义。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

SPF级雄性SD大鼠36只，由温州医科大学动物实验中心提供，体重(180～200)g。苹果多酚购自上海源叶生物技术公司；RIPA裂解液(碧云天)，BCA试剂盒(Pierce)，anti-CaSR抗体(Abclonal)，GAPDH抗体(Abclonal)，HRP标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz)，SDS-PAG制备试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 肺动脉高压模型的构建

36只大鼠按体重从大到小排序，按随机数字表法随机分成3组(n=12)：对照组(A组)，低氧诱导组(B组)，苹果多酚干预组(C组)。A组大鼠在正常环境下饲养，B、C组大鼠每天在常压低氧舱(氧浓度为10%)中间断性低氧饲养8 h，之后打开低氧舱更换饲料、水及垫料，为期四周。在模型构建的开始，C组大鼠每日用苹果多酚按200 mg/kg灌胃，A、B两组用等量生理盐水灌胃，共持续四周。常压低氧装置为自制简易低氧舱，内置测氧仪，通过调节氮气流量控制舱内氧气浓度为10%，舱底放置钠石灰和无水氯化钙以吸收舱内二氧化碳和水分。建模完成后，首先检测血流动力学指标，进而对36只大鼠进行剖胸取血，分离得到血清和血浆；灌肺并收集灌洗液，-80 ℃保存待用；取各叶肺组织待用；取大鼠的心脏待用；剥离股骨、胫骨，用于抽取骨髓。在此基础上，分别检测各大鼠的肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)、肺血管阻力(pulmonary vascular resistance, PVR)、右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index, RVHI)、肺动脉中膜厚度(medial thickness，MT)、管壁面积占血管总面积百分比(wall area as a percentage of total vascular area，WA%)、管壁厚度占血管外径百分比(percentage of wall thickness to vascular diameter ，WT%)、肺动脉组织中钙敏感受体(calcium sensitive receptor, CaSR)表达量。

1.3 肺血流动力学指标检测

大鼠称重，乌拉坦麻醉，沿右颈外静脉行肺动脉插管，最后将插管末端通过血压压力换能器连接至PowerLab生物信号采集分析系统，读取mPAP数值。用心输出量(cardiac output, CO)检测仪(ml313C, AD Instruments)和PowerLab/4SP生物信号记录分析系统测量CO。根据上述生物信号采集记录分析系统PowerLab/4SP测量得到的mPAP和CO，按下式计算ΔPVR：ΔPVR=mPAP/CO。

1.4 动物处理

血流动力学指标检测结束后，大鼠称重。乌拉坦麻醉后剖胸，剪开左心耳，向肺静脉灌注生理盐水，直至肺变成白色，剪断气管取出肺。剥离气管后处理各肺叶：左肺上叶的肺组织经研磨、离心，备提蛋白质；左肺下叶用多聚甲醛固定后进行石蜡包埋。其余肺组织及心脏保存于4 ℃冰箱中待用。

1.5 右心室肥厚指数测定

用生理盐水清洗大鼠心脏后，用眼科剪自肺动脉沿右心室边缘游离并剪切右心室壁，将剩余心脏的结缔组织和血管清除干净即为室间隔和左心室部分，分别进行称重。按下式进行计算：RVHI=RV/(LV+S)。(RV：右心室游离壁厚度，LV：左心室游离壁厚度，S：室间隔厚度)。

1.6 HE染色

将肺组织进行石蜡包埋、切片。将组织切片置60 ℃烤箱中2 h，过两次二甲苯(每次10 min)；无水乙醇、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精依次浸泡3 min；用双蒸水浸泡5 min后，置苏木素中染色3 min；用双蒸水冲洗数秒钟后，置0.5%盐酸酒精中脱分化数秒，然后将切片浸泡于双蒸水中20 min；取出切片，放入伊红染液中10 min。取出切片，用双蒸水冲洗1 min后风干，中性树脂封片；用显微镜观察。

1.7 WA%和WT%的测定

采用病理图像分析软件Image-pro Plus，分别测出血管环的外周长P1、内周长P2、管总面积A1、管腔面积A2、血管环外环的平均直径D1、内环的平均直径D2，再根据公式计算得到WA%和WT%数值。

WA%=管壁面积/管总面积=(A1-A2)/A1

WT%=血管壁厚度/血管环外周长=(D1-D2)/P1

1.8 Western Bolt检测CaSR的表达

配制含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1 ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液)。称重250 mg组织放入EP管中，加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂1 ml。用匀浆器低速匀浆，每次30 s，每两次匀浆之间冰浴1 min，直至组织完全裂解。匀浆液于预冷的离心机中14 000×g离心15 min，立即将上清液转移至新的离心管中保存待用。以β-actin为标准，测定蛋白质浓度，制备凝胶，电泳，转膜，滴加一抗孵育过夜，滴加HRP标记二抗孵育2 h，曝光检测荧光强度。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 苹果多酚对低氧诱导大鼠肺血流动力学及右心室肥厚指数的影响

低氧诱导组大鼠mPAP为(57.60+3.23) mmHg、PVR为(727.03+4.57) mmHg×min/L，较对照组mPAP(20.28+0.71) mmHg、PVR(222.37+16.58) mmHg×min/L明显升高(P<0.01)，而苹果多酚干预组mPAP为(36.08+2.12) mmHg、PVR为(399.70+137.42) mmHg×min/L，均较低氧诱导组明显降低，其差异有统计学意义(P<0.01，图1)。

Fig.1Effects of applephenon on pulmonary hemodynamics of hypoxia-induced rats(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group; APP+Hypo: Applephenon-intervented group

**P<0.01vshypoxia-induced group

对照组RVHI为(0.223±0.009)，低氧诱导组为(0.281±0.053)，苹果多酚干预组为(0.224±0.025)。与对照组比较，低氧诱导组RVHI明显增加；与低氧诱导组比较，苹果多酚干预组RVHI明显降低(P<0.01，图2)。

Fig.2Effects of applephenon on right ventricular hypertrophy index of hypoxia-induced rats(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group; APP+Hypo: Applephenon-intervented group

**P<0.01vshypoxia-induced group

2.2 苹果多酚对低氧诱导大鼠肺微小动脉重构的影响

如HE染色图片所示：与对照组比较，低氧诱导组大鼠动脉管壁明显增厚，而苹果多酚干预组大鼠动脉管壁厚度与对照组差别不明显(图3)。对照组的WA%和WT%分别为(65.3±10.5)%和(5.5±1.4)%，低氧诱导组的WA%和WT%分别为(80.6±13.1)%和(8.1±2.5)%，苹果多酚干预组的WA%和WT%分别为(69.6±15.8)%和(6.4±2.6)%。与对照组比较，低氧诱导组WA%和WT%分别增加至其1.2倍和1.5倍(P<0.01)，而苹果多酚干预组升高不明显(图4)。

Fig.3HE staining pattern of lung tissue(×200)

A: Control group； B: Hypoxia-induced group； C: Applephenon-intervented group

Fig.4WA% and WT% of small pulmonary vessels(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group; APP+Hypo: Applephenon-intervented group

**P<0.01vshypoxia-induced group

2.3 CaSR的表达

对照组CaSR为(0.133±0.021)，低氧诱导组为(0.308±0.061)，苹果多酚干预组(0.179±0.017)。与对照组相比，低氧诱导组增加至其2.3倍(P<0.01)，而苹果多酚干预组为其1.3倍(P<0.05，图5)。

Fig.5Effects of applephenon on the expression of calcium sensitive receptor (CaSR)of hypoxia-induced rats(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group;

App+Hypo: Applephenon-intervented group

*P<0.05,**P<0.01vshypoxia-induced group

3 讨论

肺动脉高压是多种心肺疾病发生发展的重要病理环节，由于目前尚无根治肺动脉高压的有效药物，肺动脉高压患者的病情呈进行性恶化趋势[2]。肺动脉高压的发生机制非常复杂，至今尚未完全阐释清楚，严重制约了肺动脉高压治疗的进展。在众多机制中，较为公认的是炎症和过氧化机制，其中肺血管收缩增强与肺血管结构重建是其共同的病理生理变化。炎性因子和氧自由基释放增加，导致肺动脉平滑肌细胞损伤、凋亡和脱落，进而使血管舒张因子(如NO、前列环素等)和血管收缩因子(如ET-1，血栓素等)平衡失调，血管平滑肌促有丝分裂和抗有丝分裂失衡，肺动脉中膜平滑肌细胞增殖，肺动脉肌性血管层增厚，无肌性血管层出现肌层及内膜新生和丛状病变，从而导致肺血管的收缩和重构，最终致肺动脉高压形成[6-8]。本实验结果显示，SD大鼠间断低氧暴露4周后，出现典型的低氧性肺动脉高压，表现为大鼠肺动脉平均压、肺血管阻力、右心室肥厚指数、肺动脉中膜厚度、WA%和WT%指数、肺动脉组织中CaSR表达量均较对照组明显升高，而应用苹果多酚进行干预后，上述变化得到明显改善。

最新研究发现，细胞外CaSR与促代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor，mGluR)、γ-氨基丁酸B受体(GABAB receptors)、味觉受体第一家族(T1R)1～3及孤儿G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)一起，组成了化学感应系统中的GPCRs C家族。该家族能感应细胞外Ca2+浓度的改变，介导与之相关联的细胞活动。Guo等[9]认为，肺动脉平滑肌细胞内Ca2+浓度的增加，是肺血管收缩的主要原因，是肺动脉平滑肌细胞迁移和增殖的重要刺激因素，进而引起肺血管重构以及PVR增加，如利用钙拮抗剂抑制平滑肌细胞膜Ca2+内流，可有效缓解肺动脉高压。Smith等[10]认为，PAH患者肺动脉平滑肌细胞Ca2+信号的增强主要表现为以下几个方面：静息状态下细胞内Ca2+浓度增加、增强储存Ca2+的进入、上调受体操纵的Ca2+进入，其中上调CaSR是PAH患者增强Ca2+信号通路、增强肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的主要机制。Peng等[11]研究发现，肺动脉高压动物模型CaSR的竞争性拮抗剂——NPS2143，可以防止肺动脉高压和右心室肥厚的发生。本团队实验也证实：PAH患者PASMC细胞外CaSR高表达，而苹果多酚能有效调控肺动脉平滑肌上CaSR的表达量，使其降低并接近于正常水平，从而减少肺动脉平滑肌Ca2+的内流，减少Ca2+与肌钙蛋白结合，抑制平滑肌兴奋-收缩偶联，进而缓解肺血管收缩，减弱平滑肌细胞的增殖，抑制动脉管壁增厚，降低肺血管压力、舒张血管，逆转肺血管重构，有效缓解肺动脉高压；同时，苹果多酚通过各种互补机理能保护肺血管内皮细胞，清除肺动脉损伤时的炎性因子和氧自由基，使之免遭过氧化作用，阻止肺血管壁平滑肌细胞的增殖和肺血管重构，维持心血管壁的完整性。

此外，根据Wang等[12]与Smith等[10]研究与基因序列分析，发现小RNA-16 (miRNA-16)与CaSR的mRNA有着8个核苷酸的互补序列，具有高度相关特异性，即miRNA-16通过调控PASMCs上CaSR，参与肺动脉高压的发生与发展。若能干扰此通路的信号转导，就能达到预防和治疗肺动脉高压的目的。苹果多酚是否能通过上述途径从根本上干预肺动脉高压有待进一步研究。