高效液相色谱－示差折光检测器法测定牛磺酸颗粒和滴眼液中牛磺酸含量

仵淑红，王丽霞

（北京市东城区食品药品安全监控中心，北京 100050）

牛磺酸（taurine）广泛分布于人体内各组织、器官，是人体生长、发育必需的氨基酸。牛磺酸对中枢神经系统、视觉发育系统有重要作用，还具有增强心肌收缩力、抗心律失常、钙流动调控、促进胆汁分泌、解毒、提高机体免疫等生物学功能［1］。牛磺酸颗粒作为解热镇痛药，可缓解感冒初期的发热，适用于感冒、扁桃体炎、支气管炎、风湿性关节炎等。牛磺酸滴眼液用于牛磺酸代谢失调引起的白内障治疗，也可用于急性结膜炎、疱疹性结膜炎、病毒性结膜炎的辅助治疗。由于牛磺酸的紫外吸收较弱，2015 年版《中国药典（二部）》［2］对牛磺酸片剂、胶囊剂和散剂采用中和滴定方法测牛磺酸含量，方法衍生步骤比较烦琐，同时要求在反应管中进行，对仪器的配置要求较高。其他测定方法还有高效液相色谱－蒸发光散射检测法［3］、自动电位滴定法［4］、分光光度法［5］、质谱法［6］等。国家药品标准［7］采用苯乙烯共聚体与磺基（Ca－配位）结合的凝胶为填充剂，内消旋肌醇为内标物的高效液相色谱－示差折光检测器法可对复方牛磺酸滴眼液中牛磺酸成分进行分析。本研究中采用示差折光检测器，NH2柱为分析柱，建立了牛磺酸颗粒和牛磺酸滴眼液中牛磺酸含量的高效液相色谱分析方法。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，Agilent 1260示差折光检测器（1260－RID）；XP205型电子天平（梅特勒－托利多）；Satorius 611DI纯化水系统；FB15065型超声波清洗器（Fisher Scientific）。

试药：牛磺酸对照品（批号为111616－201605，含量为 100．0% ），丙氨酸对照品（批号为 140680－200803，含量为99．9%），均购于中国食品药品检定研究院；牛磺酸颗粒（A厂，批号为160601；B厂，批号为20160522；C厂，批号为 151108），规格均为每袋0．4 g；牛磺酸滴眼液（A 厂，批号为 16011501，规格为每支 0．4 g∶8 mL）；牛磺酸滴眼液（B厂，批号为161204，规格为每支0．5 g∶10 mL）；牛磺酸滴眼液（C厂，批号为 161001，规格为0．5 g ∶10 mL）；乙腈为 Fisher Chemical色谱纯，试验用水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 溶液制备

取牛磺酸对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加流动相溶解，制成质量浓度为1．6 g／L的牛磺酸对照品贮备液；精密量取5 mL，置20 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得质量浓度为0．4 g／L的对照品溶液。

取牛磺酸颗粒细粉适量（相当于牛磺酸100 mg），精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，制成质量浓度为2 g／L的牛磺酸颗粒供试品贮备液；精密量取续滤液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成质量浓度为0．4 g／L的牛磺酸颗粒供试品溶液A。精密量取牛磺酸滴眼液2 mL（相当于牛磺酸100 mg），置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，制成质量浓度为2 g／L的牛磺酸滴眼液贮备液；精密量取续滤液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成质量浓度为0．4g／L的供试品溶液B。取流动相，即得空白溶液。

取牛磺酸和丙氨酸对照品各约10 mg，精密称取，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性试验溶液。

2．2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters NH2柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：水 －乙腈（40 ∶60）；流速：0．8 mL ／min；柱温：35．0 ℃；参比池温度：35．0 ℃；检测池温度：35．0 ℃；进样量：20 μL。分别取 2．1 项下 5 种溶液，按拟订色谱条件进样，牛磺酸保留时间为6．217 min，丙氨酸保留时间为 6．873 min，丙氨酸与牛磺酸完全分离，分离度为2．66，牛磺酸峰理论板数为11 614。在供试品溶液A色谱图中，牛磺酸保留时间为 6．273 min，5．601 min 处出现一峰，两峰分离度为3．03，该峰对牛磺酸的测定无干扰；供试品溶液B色谱图中，除溶剂外未发现干扰峰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2．3 方法学考察

线性关系考察：取牛磺酸对照品约50 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取 5．00，4．00，3．00，2．00，1．00，0．50，0．25 mL，置 10 mL 容量瓶中，制成质量浓度为 1．00，0．80，0．60，0．40，0．20，0．10，0．05 g ／L 的牛磺酸对照品溶液。按拟订色谱条件，进样20 μL，记录峰面积，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝195 768．56X ＋1 085．93，r＝0．998 58（n ＝7）。结果表明，牛磺酸质量浓度在 0．05 ～1．00 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别取线性关系考察项下质量浓度为1．00，0．40，0．05 g／L 的对照品溶液，按拟订色谱条件进样 20 μL，结果的 RSD 分别为 0．31% ，0．37% ，0．36%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取质量浓度为0．4 g／L的对照品溶液，室温放置，按拟订色谱条件分别在制备后0，1，2，4，6，20，24 h 时进样 20 μL。结果的 RSD 为 0．28%（n ＝7），表明对照品溶液在24 h内稳定。

表1 牛磺酸加样回收试验结果（n＝9）

检测限确定：取质量浓度为0．4 g／L的牛磺酸对照品溶液，逐步稀释，按拟订色谱条件进样20 μL，记录色谱图。结果信噪比为 3 ／1 时，检测限为 0．5 μg ／mL。

加样回收试验：分别精密量取2．1项下牛磺酸颗粒供试品贮备液 1．6，2．0，2．4 mL，共 9 份，分别置 10 mL容量瓶中，分别加入牛磺酸对照品贮备液 2．0，2．5，3．0 mL，加流动相稀释至刻度，按拟订色谱条件分别进样20 μL，记录色谱图，计算回收率。结果见表1。精密量取2．1项下牛磺酸滴眼液供试品贮备液2 mL，共9份，分别置10 mL容量瓶中，以80%，100%，120%3个水平浓度精密加入牛磺酸对照品贮备液2．0，2．5，3．0 mL，加流动相稀释至刻度，按拟订色谱条件分别进样20 μL，记录色谱图，计算回收率。结果见表1。

2．4 样品含量测定

取3批牛磺酸颗粒、牛磺酸滴眼液和牛磺酸对照品适量，精密称定，依法制备供试品溶液和对照品溶液，按拟订色谱条件分别进样20 μL，记录色谱图，按外标法计算含量。结果3批牛磺酸颗粒样品（批号分别为160601，20160522，151108）的牛磺酸含量分别为98．33%，103．42%，100．54%；3批牛磺酸滴眼液样品（批号分别为 16011501，161204，161001）的牛磺酸含量分别为93．67%，96．65%，99．08% 。

3 讨论

牛磺酸化学结构式H2N—CH2—CH2—SO3H，相对分子量为125．15，易溶于水，不溶于无水乙醇、乙醚和丙酮。由于牛磺酸分子量相对较小，无苯基类疏水集团，在药物分析常用的十八烷基硅胶柱上的保留能力较弱，试验初期采用C18柱，水－乙腈不同比例分析，其保留时间比较短。分子中具有极性氨基、磺基亲水基团，在水和乙腈体系流动相中，能与氨基柱的氨基基团达到保留，增大流动相中乙腈的比例，牛磺酸的保留时间增加，水－乙腈（40∶60）流动相条件下，氨基柱对牛磺酸的保留时间达到6 min，理论板数达11 614，分离效果良好。由于牛磺酸溶解能力限制，继续增加流动相中乙腈比例至水－乙腈（30∶70），牛磺酸不能充分溶解，因此选择水－乙腈（40∶60）为流动相，氨基柱为分析柱。

2015 年版《中国药典》［2］、美国药典 USP35 －NF30［8］和日本药典JP17［9］，未收载明确的牛磺酸杂质。参考2015 年版《中国药典》［2］和文献［10］，选择丙氨酸和牛磺酸作为系统适用性溶液考察方法的专属性，分离度良好。专属性试验表明，在牛磺酸色谱峰处无干扰峰。加样回收试验结果表明，回收率满足要求。