盐生草HgNHX1基因在大麦株系中的功能验证

张 燕，李葆春，胡有良，汪军成，任盼荣 ，姚立蓉 ，马小乐 ，孟亚雄 ，杨柯，王化俊

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070； 3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070)

土壤盐碱化和干旱是影响作物生长的两个主要非生物胁迫，特别是在干旱和半干旱地区，这两种非生物胁迫对农业生产具有毁灭性的影响，因此，改善作物的耐盐、抗旱性对干旱和半干旱地区的农业发展具有重要意义。而大麦(HordeumvulgareL.)是一种重要的旱地农作物，可用于制造啤酒、食品及饲料等[1]。利用基因工程技术可以对大麦品种进行定向改良，培育出抗旱耐盐的新品种；而对大麦转基因的研究将为其定向改良提供重要的理论依据。Kim等[2]对导入亚硒酸盐抗性基因的大麦株系进行亚硒酸盐胁迫，发现其硫氧还蛋白基因表达量上升，植株生长较好。Delhaize等[3]探究了高浓度铝离子和酸性条件对导入耐铝基因ALMT1的大麦生长发育的影响，获得了对高浓度铝具有抗性的转基因植株，并且发现该植株根系对磷的吸收作用也增强。Morran等[4]将小麦中具有抗旱功能的2个转录因子分别导入大麦，进行干旱胁迫，发现转基因株系的生长特性优于野生型株系，且发现基因的过量表达有利于提高其抗旱性。

Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)是一种广泛存在于生物体中的调控Na+/H+跨膜转运的膜蛋白，在维持机体的动态平衡和抵御盐胁迫方面发挥着重要作用。植物NHX首先在大麦中被发现[5]，随后，在水稻[6]、拟南芥[7]、滨藜[8]、甜菜[9]、油菜[10]、大麦[11]、棉花[12]、玉米[13]、小麦[14]和大豆[15]等多种植物中均克隆出NHX蛋白的同源基因。HgNHX1基因为液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因，从具有极强耐盐性的盐生草中克隆所得[16]。对转AtNHX1基因的拟南芥、番茄和油菜进行试验分析，发现AtNHX1基因在植物中过量表达会明显增强植物的耐盐性。研究发现，在盐碱土壤中，转AtNHX1基因的小麦籽粒大而重，产量得到提高；在200 mmol·L-1NaCl处理下，转AtNHX1棉花的植株产量显著增加，产生的棉纤维更多。然而，关于转HgNHX1基因对大麦植株抗逆性的影响，尚很少有研究报道。本研究以转HgNHX1基因的大麦阳性植株为材料，测定其相关的生理指标，以期为获得抗旱耐盐大麦品种的研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

本试验以甘啤4号T0代转HgNHX1基因大麦株系所收获的T1代种子为试验材料(转基因阳性植株的筛选及其HgNHX1基因的PCR检测参见胡有良[17]的方法)，以甘啤4号的野生型大麦种子作对照。这些材料均由甘肃省干旱生境作物学重点实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 转基因大麦幼苗的盐及干旱胁迫处理

对T1代转HgNHX1基因和野生型大麦种子每单株种于营养钵中，每个材料分别种植12盆，每盆5株，30 d时将其分为2组，并分别进行盐和干旱胁迫处理。盐处理如下：(1)1/2 Hoagland营养液(对照)和1/2 Hoagland营养液+150 mmol·L-1NaCl溶液连续浇灌15 d，期间定时观察表型，拍照并记录表型变化；(2)1/2 Hoagland营养液(对照)和1/2 Hoagland营养液+150 mmol·L-1NaCl的溶液浇灌7 d后采样，然后浇灌正常的1/2Hoagland营养液3 d后采样。干旱处理如下：(1)自然干旱处理15 d，期间定时观察表型变化，拍照并记录；(2)自然干旱-复水处理，在干旱前、干旱7 d后(复水前)和干旱7 d并复水3 d 后三个时间点采样。标记清楚后置液氮中速冻，-80 ℃保存备用。

1.2.2 盐和干旱胁迫下转基因大麦株系中HgNHX1 基因相对表达量的测定

将转基因植株分别进行盐和干旱胁迫处理，并分别于0、1 和3 d及0、3和7 d取样。以大麦actin基因作为内参基因，利用荧光染料法进行实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)，采用2-△△Ct法计算胁迫处理下转基因大麦株系中HgNHX1基因的相对表达量。每个处理设置3个生物学重复。

1.2.3 大麦中相对含水量、相对电导率、丙二醛和游离脯氨酸含量的测定

相对含水量(relative water content，RWC)参考张慧[18]的方法进行测定；相对电导率(relative electric conductivity，REC)采用陈爱葵[19]的方法进行测定；丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法[20]进行测定；游离脯氨酸(L-proline，L-Pro)含量采用茚三酮显色法[21]测定。每个处理设置3 次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 盐和干旱胁迫下转基因大麦中HgNHX1基因的相对表达量分析

qRT-PCR结果(图1)表明，随着盐胁迫时间的延长，转基因大麦株系中HgNHX1 基因相对表达量逐渐上升；随着干旱胁迫时间的延长，该基因的相对表达量呈先上升后下降的趋势，在第3天达到最大值。说明HgNHX1基因可能参与大麦对盐和干旱胁迫的应答反应。并且，在盐和干旱胁迫下转基因大麦株系中HgNHX1 基因相对表达量与对照的差异均达到显著水平(P<0.05)。

2.2 盐和干旱胁迫过程中大麦株系表型的变化

对生长30 d的大麦株系进行盐胁迫处理，表型变化如图2A 所示。胁迫处理前，野生型大麦株系WT和转基因大麦株系T表型无明显差异，都生长良好(图2A-a)；盐胁迫处理7 d时，各株系基部叶片叶尖都出现黄化和轻微萎蔫的现象，转基因株系叶片较野生型大麦株系叶片颜色更深绿，其他无明显差异(图2A-b)；盐胁迫处理15 d后差异较明显，同时出现萎蔫且有较多叶片变黄、失绿，但野生型大麦的症状更严重(图2A-c)。自然干旱胁迫前的转基因大麦株系和野生型大麦株系均生长良好(图2B-d)；干旱胁迫处理7 d的大麦株系都出现少量黄叶和轻微萎蔫的现象，但转基因大麦株系茎秆更加粗壮，长势更好(图2B-e)；干旱处理15 d的大麦株系生长都受到了不同程度的抑制，但转基因大麦株系长势优于野生型大麦株系，具体表现为转基因大麦株系只有少部分靠近根部的叶片变黄枯死，而野生型大麦株系整株叶片几乎都变黄枯死(图2B-f)。由以上结果可初步推测转基因大麦株系的抗旱耐盐性较野生型株系强。

2.3 在盐、干旱胁迫条件下转基因大麦相关生理指标的变化

由表1可知，转基因和野生型大麦株系的RWC在盐、干旱胁迫处理下呈现出相似的变化趋势：胁迫处理7 d后各大麦株系RWC均显著降低，停止胁迫处理3 d后显著提高，且转基因大麦株系在盐胁迫后的下降程度低于野生型大麦株系，转基因大麦株系的RWC比野生型大麦株系高9.0%，停止胁迫处理3 d后的上升程度高于野生型大麦株系，转基因大麦株系的RWC比野生型大麦株系高10.2%。自然干旱胁迫处理7 d后，各大麦株系RWC都显著下降，转基因大麦株系RWC高于野生型大麦株系，但差异不显著；复水处理3 d后，大麦株系RWC显著回升，转基因大麦株系RWC显著高于野生型大麦株系。因此，对于转基因大麦株系而言，盐和干旱胁迫所造成的水分损失少于野生型大麦株系，说明HgNHX1基因在转基因大麦株系中能够正常表达并提高了转基因大麦株系在盐和干旱胁迫下的保水能力，从而使得转基因大麦株系在盐和干旱胁迫下能够维持较高的水分代谢水平。

图柱上的小写字母不同表示在0.05水平上差异显著。Different lower-case letters above bars indicate significantly different at 0.05 level.

WT：野生型大麦株系；T：转基因大麦株系；A：盐胁迫下大麦表型；B：干旱胁迫下大麦株系的表型。a：盐胁迫处理前；b：盐胁迫处理7 d时；c：盐胁迫处理15 d时；d：干旱胁迫处理前；e：干旱胁迫处理7 d时；f：干旱胁迫处理15 d时。WT:wild-type barley lines; T:transgenic barley lines; A:phenotype of barley under salt treatment B:phenotype of barley under drought treatment; a:phenotype of barley before salt treatment; b:phenotype of barley under salt treatment for 7 days; c:phenotype of barley under salt treatment for 15 days; d:phenotype of barley before drought treatment; e:phenotype of barley under drought treatment for 7 days; f:phenotype of barley under drought treatment for 15 days.

两种胁迫处理后，REC、MDA含量和L-Pro含量的变化趋势总体一致，均为胁迫处理7 d显著上升，停止胁迫处理3 d后又显著下降，且转基因大麦株系在盐、干旱胁迫后的上升程度与停止胁迫处理后的下降程度均低于野生型大麦株系。

盐胁迫处理前及停止胁迫处理3 d 后，转基因大麦株系的REC、MDA含量和L-Pro含量均比野生型大麦株系低，但差异均未达到显著水平。盐胁迫处理7 d时，转基因大麦株系的REC和MDA含量显著低于野生型大麦株系，分别为野生型大麦株系的92.40%和89.26%； L-Pro含量显著高于野生型大麦株系，是野生型大麦株系的1.08倍。

干旱胁迫处理前，转基因大麦株系的REC、MDA含量和L-Pro含量均比野生型大麦株系低，但差异均未达到显著水平。干旱胁迫处理7 d时，转基因大麦株系的REC和MDA含量显著低于野生型大麦株系，分别为野生型大麦株系的76.58%和76.46%；L-Pro含量显著高于野生型大麦株系，是野生型大麦株系1.39倍。停止干旱胁迫并复水处理3 d后，转基因大麦株系的REC和MDA含量仍然显著低于野生型大麦株系，分别为野生型大麦株系的81.48%和79.72%；L-Pro含量与野生型大麦株系差异不显著。

以上结果说明，盐和干旱胁迫造成转基因大麦株系的电解质外渗量少于野生型大麦株系，HgNHX1基因在转基因大麦株系中的表达能够缓解盐、干旱胁迫对细胞膜的伤害。

表1 盐、干旱胁迫对大麦相对含水量、相对电导率、丙二醛含量和游离脯氨酸含量的影响Table 1 Effect of salt and drought stress on relative water content, relative electric conductivity, malondialdehyde content and free proline content in barley

3 讨 论

研究发现，在许多植物中，NHX1的过量表达都能够显著增加植物的耐盐性。盐胁迫会导致植物内的离子均衡受到一定程度的破坏，从而影响到细胞对K+的吸收，同时细胞质中过多的Na+会产生离子毒害，阻碍细胞正常生长甚至会导致死亡。降低细胞中过多Na+有很多方法，如Na+区隔化。研究发现，Na+区隔化能有效的将细胞质内Na+维持最低状态。植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白是将细胞中过多Na+区隔化进液泡中的关键因素，它会利用质子泵产生的驱动力，逆着Na+浓度梯度，将细胞质中的Na+区隔化进液泡中[22]。本试验通过150 nmol·L-1NaCl胁迫处理转基因HgNHX1大麦株系，利用qRT-PCR技术研究其在大麦中的表达特性及表达丰度。结果表明，正常情况下，HgNHX1表达量较低，盐胁迫诱导后的表达量随处理时间的延长而升高，说明HgNHX1基因很可能参与了大麦抗盐胁迫反应，这与徐先良等[16]在盐生草中的研究结果相似。为进一步探究基因的功能，本研究分析了在盐胁迫环境下转HgNHX1基因大麦的各个生理指标，主要为两个正相关指标(如RWC和L-Pro含量)和两个负相关指标(如REC和MDA含量)，即在三个不同处理时间点(正常情况下、盐胁迫后和恢复正常情况后)，转HgNHX1基因大麦株系RWC和L-Pro含量均高于野生型大麦株系；REC和MDA含量均低于野生型大麦株系。本结果与前人在其他植物中研究报道的结果有差异[23]，可能是因为大麦本身具有很强的耐盐性，或是HgNHX1基因对于提高大麦株系耐盐性的效果不显著。

在干旱胁迫环境下，植物常常通过自我保护机制即减少叶面积、降低植株高度和抑制代谢活动等继续存活。本试验通过自然干旱胁迫处理转基因HgNHX1大麦株系，结果表明，随着干旱胁迫时间的延长，转基因大麦株系中HgNHX1 基因相对表达量逐渐上升，且在处理3 d时达到最高，说明HgNHX1基因可能参与了大麦对干旱胁迫的应答反应。本文还分析了在干旱胁迫环境下转HgNHX1基因大麦的各种生理指标，即在三个不同处理时间点(正常情况下、干旱胁迫后、复水3 d后)，转HgNHX1基因大麦株系RWC和L-Pro含量均显著高于野生型大麦株系；REC和MDA含量均低于野生型大麦株系。研究结果与前人在其它植物中研究报道的结果基本一致，可能是因为大麦本身具有很强的抗旱性，或是HgNHX1基因对于提高大麦株系抗旱性的效果较显著。

本研究通过盐和干旱胁迫处理转HgNHX1基因大麦阳性植株和野生型大麦植株，由各生理指标的变化得出，HgNHX1基因在转基因大麦中能够正常表达并提高转基因大麦的保水能力和耐盐抗旱性，从而使得转基因大麦能够维持较高的水分代谢和抗旱耐盐机制；HgNHX1基因更能够降低盐、干旱胁迫对植物细胞膜系统的损伤，具有更强的抗氧化能力。总而言之，HgNHX1基因参与了大麦对盐、干旱胁迫的应答反应。但由于实验试材较单一，本实验抗旱耐盐生理指标的测定值，不能简单地作为判断其抗旱耐盐性的依据，但为进一步深入研究提供了可靠的数据参考，为探索大麦抗旱耐盐分子机理提供了实验依据，为大麦抗旱耐盐基因工程奠定了理论基础。