青海省马铃薯黑胫病病原菌的鉴定

王 信，程 亮，王亚艺，高旭升，李松龄

(青海大学 农林科学院/省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科多年生草本植物，原产于南美洲安第斯山区，是世界第四大粮食作物，在中国各地均有种植[1-2]。马铃薯黑胫病(potato blackleg)属细菌性病害，近年来在我国东北、西北、华北和西南马铃薯主产地区均有不同程度的发生[3]。该病菌主要侵染维管束组织，可侵染马铃薯的茎和块茎，从种薯发芽到生长后期均可发病，以苗期最盛。马铃薯是青海省的主要粮食作物之一，是调整农业产业结构中重点发展的十大产业之一，是当地最具市场竞争力的优势农产品之一，是青海省浅山、脑山地区农民的主要经济来源。2013年青海省马铃薯种植面积达到9.56万hm2，总产量达到2 150万t，仅次于小麦、油料，成为第三大作物；但黑胫病造成马铃薯烂种死苗，品质、产量大幅降低，已成为制约青海省马铃薯产业发展的瓶颈。

目前，已报道的引起马铃薯黑胫病的病原菌有Dickeyaspp. (syn.Erwiniachrysanthemi或Pectobacteriumchrysanthemi)[4-6]、P.atrosepticum(syn.E.carotovorasubsp.atroseptica) (Pa)[7]、P.carotovorumsubsp.carotovorum(syn.E.carotovorasubsp.carotovora) (Pcc)[8]和P.carotovorum. subsp.brasiliensis(Pcb)[9]。多数研究结果认为，P.atrosepticum是引起温带地区马铃薯黑胫病的主要致病菌，而Dickeyaspp.则是热带亚热带马铃薯黑胫病的主要病原[10]。虽然已证实Pcc可以感染马铃薯块茎，引起黑胫症状，但该亚种却是引起温带地区马铃薯黑胫病的次要病原菌[8]。迄今为止，仅仅在亚热带地区感染的马铃薯黑胫病样中发现Pcb[9]；在北美和西欧，马铃薯黑胫病的主要致病菌依然为Pa，Pa也是我国部分地区马铃薯黑胫病的主要病原[11-12]。青海地区马铃薯黑胫病致病菌鲜有文献报道。本研究从青海地区大通县、湟中县、湟源县、乐都县和民和县等马铃薯生产地病样组织中分离病原菌，通过形态特征、生理生化和致病性以及16S rRNA序列分析进行病原菌鉴定，同时比较分析不同菌株的致病力，以期为马铃薯黑胫病的早期诊断和防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病样采集及培养基

2016年6—8月，在青海省的大通县、湟中县、湟源县、乐都县和民和县的马铃薯生产田采集马铃薯黑胫病病样。

结晶紫果胶酸盐选择性培养基(CVP)：在500 mL沸腾的蒸馏水中依次加入1 mL 0.75 g·L-1结晶紫溶液、1 mol·L-1NaOH溶液4.5 mL、100 g·L-1CaCl2·2H2O溶液3 mL(新鲜溶液)、3.0 g琼脂粉、1.0 g NaNO3、9.0 g聚果胶酸钠，待聚果胶酸钠加入时人工搅拌30 s，然后分别装入三角瓶，121 ℃灭菌20 min。

Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，琼脂粉15 g，用去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0。然后分别装入三角瓶，121 ℃灭菌20 min。

1.2 病原菌分离

在超净工作台中，称取0.1 g病块茎置于250 mL的三角瓶中，并加入100 mL灭菌蒸馏水，放入玻璃珠充分打散混合，置于120 r·min-1摇床培养30 min后，充分摇匀。用无菌水将菌悬液依次稀释成10-2～10-7的稀释液，每个浓度进行3次平行试验，分别涂布到CVP培养基上。25～27 ℃黑暗培养48 h，将典型形态的菌落在CVP培养基反复划线，进行纯化培养，挑取单菌落进行编号和保存。

1.3 致病力测定

将保存的5个菌株在LB培养基上活化，配成5×108cfu·mL-1菌悬液。选取生长6周的马铃薯植株(品种为大西洋)，采用针刺法接种。用灭菌牙签醮取菌悬液插入从基部数第3个叶腋，接种部位用凡士林涂抹保湿。每个菌株接种10株马铃薯。相对湿度100%，保湿24 h后，置于大棚中。棚内昼夜温度16～21 ℃，湿度65%～85%。接种72 h后测量病斑的长度，取平均值作为病斑平均长度；同时，从发病植株分离病原菌进行观察鉴定。根据文献[13]的分级标准进行记录：病斑长度1～5 mm为弱致病力菌株，5.1～10 mm为中等致病力菌株，10 mm以上为强致病力菌株。

1.4 菌株形态和生物化学特性分析

菌株的菌落形态观察、革兰氏染色、柠檬酸盐分解和37 ℃生长测定参考《植病研究方法》[14]。病原菌对蔗糖、麦芽糖、山梨醇、阿拉伯醇、乳糖和α-甲基葡糖苷等的利用测定参考《伯杰氏细菌鉴定手册》[15]和《植病研究方法》[14]。以本实验室保存的黑胫病致病菌Pa(编号Pa11)为对照菌株。

1.5 16S rRNA的扩增和序列分析

1.5.1 基因组DNA的提取

使用Ezup柱式SK8255试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取马铃薯黑胫病病菌的DNA。取1 μL DNA溶液用1.5%(体积质量)琼脂糖凝胶进行电泳检测，-20 ℃保存备用。

1.5.2 16S rRNA片段的扩增

采用细菌通用引物(27f: 5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′；1942r: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增。PCR反应体系25 μL: 2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL(编号为KT201-02，Tiangen)，DNA模板(50 ng·L-1)1μL，引物27f和1942r (20 μmol·L-1)各1 μL，双蒸水9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40 个循环；72 ℃ 10 min。回收大小约1.5 kb的PCR产物，将其连接到pGEMT-Easy载体(Promega corp.，美国)，转化大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞。重组质粒经NotⅠ酶切和PCR鉴定后，送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5.3 16S rRNA系统发育树构建

测序结果用软件Chromas(ver. 2.4.1)进行序列修正后，在NCBI数据库Blast检索与目标序列同源性高的DNA序列，与本文所测株系序列分别进行序列比对。利用软件MEGA(ver. 5.05)的UPGMA法构建系统发育树，各分支的置信度自举检测(bootstrap)1 000次。

1.6 Pa特异引物扩增基因

用Pa特异性引物Eca1f (5′-CGGCATCATAAAAACACG-3′)和Eca1r (5′-GCACACTTCATCCAGCGA-3′)[16]扩增5个分离菌株。PCR反应体系25 μL∶DNA模板1 μL(100 ng·L-1)，2×TaqPCR Master Mix 12 μL，上游引物1 μL(20 μmol·L-1)，下游引物1 μL(20 μmol·L-1)，加ddH2O至总体积25 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。以2 000 bp DNA Marker为分子质量标准，取4 μL PCR扩增产物进行1.5%(体积质量)琼脂糖凝胶电泳，核酸染料染色观察是否有特异性带产生。选用青海大学农林科学院土壤肥料研究所农业微生物实验室保存的果胶杆菌致病菌Pa(Pa11)为对照株系。

2 结果与分析

2.1 黑胫病病原菌的形态及理化特征

从马铃薯黑胫病病样中共分离出5个菌株，命名为QDM-3、QMX-6、QDM-1、QHQ-4和QHL-7。5个菌株在CVP培养基上均向培养基内部扩展，形成杯状凹陷(图1-A)。将分离的菌株分别回接4～6叶期健康的马铃薯植株，接种24 h后，植株茎基部即开始出现褐色斑点；随着接种时间的延长，病株症状逐渐加重(图1-B)；接种72 h后病株茎基部完全变色，植株倒伏，与田间黑胫病症状表现一致。

与对照菌株Pa一样，5个菌株在LB固体培养基上菌落呈灰白色、不透明、圆形中间突起，革兰氏染色阴性，不能在37 ℃生长，不能使明胶液化，具有耐盐性(5% NaCl)，对红霉素不敏感；过氧化氢酶和蔗糖还原试验反应均为阳性；可以利用柠檬酸盐；氧化酶、吲哚产生和磷酸酶活性试验均为阴性；可利用乳糖、D-麦芽糖、棉籽糖、纤维二糖、蜜二糖和α-甲基葡萄糖产酸，不能利用山梨醇和D-阿拉伯糖(表1)。测定结果均与文献报道的黑腐果胶杆菌(P.atrosepticum)的性状相符合[12]。

2.2 16S rRNA的序列分析

PCR扩增5个菌株的16S rRNA，均得到一条大小约为1.5 kb的产物(图2)。序列比对结果表明，5个菌株与已报道的Pa的16S rRNA序列的同源性均达100%。基于16S rRNA基因完整序列，以Dickeyaaquaticastrain 174/2菌株(NCBI Reference Sequence: NR_134020.1)为外群，将5个菌株和对照菌株(Pa11)的序列与已发表的22株果胶杆菌菌株的序列构建系统发育树。结果(图3)显示，本研究分离得到的5个菌株与Pa菌株构成了明显的分枝，已发表的Pcb、Pw、Pb与Pcc株系形成的类群则分别构成了独立的分枝。

图1 病原菌在CVP培养基平板上产生杯状凹陷(A)和接种60 h后茎基部症状(B)Fig.1 Cup-shaped cavities formation of isolated pathogen from diseased stem of potato on CVP agar (A) and symptom of healthy stem at 60 h after inoculation with the pathogen (B)

表1 从田间马铃薯茎基部分离的5个菌株的生理生化特性Table 1 Physiochemical characteristics of 5 strains isolated from diseased tubers of potato plants in field

2.3 Pa特异性引物扩增结果

用Pa特异性引物Eca1f和Eca1r扩增5个菌株及对照菌株(Pa11)。结果表明，5个菌株均扩增得到一条大小约690 bp的特异条带(图4)，在对照菌株Pa11中也得到该扩增产物，进一步证实分离的5个菌株均为Pectobacteriumatrosepticum。

2.4 病原菌的致病力

用病原菌接种生长6周的马铃薯植株，接种72 h后统计病斑长度，将病斑长度作为致病力强弱的测定指标。结果表明：5个菌株的致病力有差异，致病力水平介于中等和强致病力之间；其中，菌株QLM-4、QHL-7、QDM-3在接种72 h后表现强致病力，菌株QMX-6和QHQ-4表现为中等致病力(表2)。

M，DL 2 000 DNA Marker；1，阳性对照(Pa11)；2，QLM-4；3，QHL-7；4，QHQ-4；5，QMX-6；6，QDM-3；7，阴性对照(无菌水)。M， DNA marker DL 2 000; Lane 1， Positive control Pa11; Lane 2， 3， 4， 5 and 6 represented QLM-4， QHL-7， QHQ-4， QMX-6 and QDM-3， respectively; Lane 7， Sterile water was used as negative control.

3 结论与讨论

马铃薯黑胫病是马铃薯生产上重要病害之一，近年来青海不断扩大马铃薯生产规模，黑胫病在青海省发生范围也在蔓延扩大。本研究分离纯化了青海省马铃薯黑胫病的病原菌，通过形态观察、致病性测定及16S rRNA序列比较，明确此病原菌为黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)。进一步测定该病原菌的生理生化特征，包括过氧化氢酶、氧化酶产生，明胶液化，蔗糖还原，磷酸酶活性，吲哚产物，对红霉素的敏感性，碳水化合物产酸，有机盐产酸，37 ℃生长及5% NaCl溶液中的生长情况。结果表明，本研究分离的5个菌株与对照菌株Pa11均不能在37 ℃生长，可以在5% NaCl培养基正常生长，能降解柠檬酸，这与已发表的Pa菌株表现一致。因此，确定本研究分离的5个菌株均属于Pa种[7，17-18]。

马铃薯黑胫病在广州、广西、黑龙江、甘肃、内蒙古马铃薯产区均有发生。王旭等[11]报道内蒙古自治区马铃薯黑胫病的病原为Pa，佘小漫等[12]在广东省广州市、惠州市、江门市马铃薯产区的马铃薯黑胫病样中分离的病原菌也主要是Pa。青海省马铃薯主要种植区在青海东部农业区的干旱和半干旱地区，东起民和县西至日月山，跨越河湟两大灌区的沟壑丘陵以及海北大通河畔农牧交错小块旱作区，海拔1 850～3 100 m，纵垂温暖、凉温、冷温3个农业气候带。本研究从青海温暖带气候的乐都县和民和县、凉温气候带的大通县和湟中县以及冷温气候带的湟源县分别采集的马铃薯黑胫病病样中分离的菌株也是Pa。这与前人的研究结果基本一致。

支点上的数字为Bootstrap生成的百分率。条形图表示遗传距离。The number at each branch points showed percentage supported by bootstrap. Bar indicated the genetic distance of evolutionary branches.

M， DL2 000 DNA Marker； 1， 阳性对照(Pa11)； 2， QLM-4； 3, QHQ-4； 4, QHL-7； 5, QMX-6； 6, QDM-3； 7, 阴性对照(无菌水)。M， DNA marker DL 2 000; Lane 1， Positive control Pa11; Lane 2， 3， 5， and 6 represented QLM-4， QHQ-4， QHL-7， QMX-6 and QDM-3; Lane 7， Sterile water was used as negative control.

近几年，随着Pectobacteriumsp.属的种和亚种数量逐渐增加，传统的微生物学鉴定方法受到了越来越多的挑战。P.atrosepticum和P.carotovorum是2个引起植物黑胫病的最常见的种，通过37 ℃条件下生长、α-甲基葡萄糖产酸和蔗糖还原试验很容易区分这2个种。随着P.betavasculorum，P.wasabiae，P.carotovorumsubsp.brasiliensis和P.carotovorumsubsp.odoriferum这些种和亚种的确认，单单依靠表型特征和生理生化测试进行相同种或亚种之间的准确鉴别变得比较困难。DNA标记、血清学和DNA杂交在许多植物病原细菌致病亚种和致病型区分方面有较多报道，其中16S rRNA序列分析和PCR特异性扩增方法是目前较常用的细菌系统发育分类方法[19]。16S rRNA序列系统发育树分析表明，本研究分离的5个Pa菌株与已发表的Pa株系共同形成了明显的Pa分枝，且该分枝与其他种(或亚种)形成了不同类群。从系统发育树可以看出种(Pa、Pw和Pb)与亚种(Pcc和Pcb)之间形成了明显不同的类群，利用Pa特异性引物在Pa株系和对照菌株Pa11中均能扩增得到大约690 bp的Pa特异条带，也证明本实验中引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌为黑腐果胶杆菌。

表2 5个Pa菌株的采集地点及致病力等级Table 2 Sampling sites and pathogencity level of the 5 Pa strain collections