在线固相萃取净化-离子色谱法测定烟草中的糖

张 涛，曾婉俐，向海英，张承明，李 晶，李雪梅，杨光宇，张建铎

(云南中烟工业有限责任公司 技术中心，云南 昆明 650106)

糖类化合物是烟草中的重要成分，对烟草的生长发育和成品烟叶的内在质量均有重要影响。烟草样品中含有多种糖，但葡萄糖、果糖和蔗糖占烟草中水溶性总糖含量的90%以上。因此烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定，对了解烟草的生长发育情况及成品烟叶品质的评价均具有重要意义[1]。目前，关于烟草中水溶性糖的测定文献报道很多，主要有方法有滴定法、近红外光谱法、连续流动分析法、毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法等[2-4]。

离子色谱法可以无需衍生直接进行检测低浓度糖的定量分析，几乎能分析所有的单糖和大部分的低聚糖，样品前处理操作简单，因此该技术在水溶性糖分析中得到了广泛应用[3,5-7]。目前，烟草行业标准YC/T 251─2008采用离子色谱法测定烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖[7]。但样品分析时间长(每个样品的色谱分析时间需40 min左右)；而且样品前处理采用萃取液不经净化直接进样，大量样品分析时萃取液中的干扰成分容易在离子色谱柱上富集而污染色谱柱并影响分析结果。随着烟草行业烟草基因编辑工厂化育种工作的启动，通过基因编辑将产生数万个素材，需对这些海量的素材进行快速化学分析评价，现有行业标准很难满足这些海量素材快速筛选化学分析的需求。为了寻找更简便、快速的分析方法，笔者研究了在线固相萃取净化-离子色谱法测定烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖的方法。通过色谱柱和色谱条件的优化，每个样品的色谱分析时间可缩短到10 min。通过在离子交换柱前增加反向树脂在线净化柱，可有效地在线除去样品萃取液中的小极性干扰成分，避免了这些成分污染色谱柱而影响分析结果。为了进一步简化样品前处理，笔者还通过自主设计的样品萃取瓶，可不经样品转移就可完成样品的萃取和萃取液的过滤，使样品前处理周期也大大缩短。改进的方法与目前行业标准相比，日样品分析量可提高3倍以上。该方法的建立为基因编辑素材化学筛选提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-3000多功能离子色谱仪(美国戴安公司)，包括双泵、自动进样器，安培检测器和Chromeleon 6.8色谱工作站；安培检测器工作电极为金电极，参比电极为pH/Ag/AgCl和钛对电极。

葡萄糖、果糖、蔗糖标样(瑞士Fluka公司生产，纯度均大于99%)。

葡萄糖、果糖、蔗糖标准溶液的制备：分别准确称取50 mg的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容到刻度，得到5.0 mg/mL的单标储备液；使用时分别取单标储备液用水稀释成所需浓度的混合标准工作液。

氢氧化钠为优级纯(北京化学试剂公司)；实验用水为高纯水(用Milli-Q50高纯水处理器)。

改进的样品萃取瓶见图1，样品萃取瓶由带密封圈的外套管(图1-a)和带0.45 μm过滤筛板的内套管(图1-b)组成。

图1 改进的样品萃取瓶

1.2 色谱条件

色谱柱为CarboPac PA1(4×250 mm，5m)碳水化合物分析柱，在离子色谱柱前接MCI-GEL反向树脂填料的在线固相萃取柱(4×10 mm，5 μm)；流动相为0.20 mol/L的氢氧化钠溶液，流速1.5 mL/min。PAD脉冲安培检测器(Au工作电极)，工作电位如下：0.00～0.40 s，0.1 V；0.41～0.42 s，-2.0 V；0.43 s，0.6 V；0.44～0.50 s，-0.1 V；积分区间为0.20～0.40 s。进样2.0L。

1.3 样品处理

新鲜烟叶冷冻干燥、成品烟叶样品烘箱中40 ℃烘干，然后粉碎并过40目筛。把样品萃取瓶外套管(图1-a)放到不锈钢试管架上。准确称取样品0.1 g于外套管中，用50 mL的移液枪在装有样品的套管中加入50 mL的水，然后把萃取瓶的内套管卡在外套管的口部(图1-c)。装好后把带样品瓶的试管架放到恒温超声波水浴锅中于50 ℃下超声萃取20 min。萃取完后把萃取瓶的内套管向下压，萃取溶液就通过过滤筛板进入到内套管中，并从内套管中的细弯管流出，到达样品过滤的效果(图1-d)。从细弯管口收集萃取液，弃去最初的2～3 mL，然后用色谱进样瓶直接收集1.0～1.5 mL的样品萃取液冷却到室温，供离子色谱分析用。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件

烟草样品中水溶性糖一般采用水或80%的甲醇水溶液提取；与用有机溶剂提取相比，用水提取成本低且环境污染小，烟草行业标准YC/T 251─2008中也采用水萃取样品；因此本实验选择用水为萃取溶剂。常用的萃取方法有匀浆法、振荡萃取法和超声萃取[5]；高速匀浆法效率高，但每次只能处理1个样品；而超声和震荡萃取可一批样品(数十个样品)同时处理，样品量大前处理效率更高。超声萃取与震荡萃取比较，超声萃取的效率明显高于震荡萃取，因此本实验选用震荡萃取。实验结果表明：提高温度有利于提高样品中糖的溶出，缩短萃取时间；每0.1 g的样品用50 mL的水提取，在室温下需超声30 min左右，样品中的糖才能完全溶出；但在50 ℃左右超声萃取15 min，样品中的糖就可完全溶出，继续延长萃取时间对分析结果无明显影响。因此本实验中选择在50 ℃左右超声萃取20 min。

另外，在萃取烟草中的水溶性糖时，少量的蜡质，色素、多酚、脂肪类物质等物干扰成分也有可能转移到萃取液中，这些成分不能被离子色谱的流动相洗脱，容易在色谱柱上残留而污染色谱柱，进而影响分析结果。苏轶[8]、王璐[9]等采用C18固相萃取净化样品并取得较好的分析效果；但固相萃取的引入增加了样品前处理操作步骤。为了简化样品操作步骤，本实验选择在离子色谱柱前接MCI-GEL反向树脂填料的在线固相萃取柱；MCI-GEL反向树脂基体是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物，与C18具有相似的保留行为，但使用的pH范围比C18宽，在pH 0～14范围内均可稳定使用，因此特别适合在离子色谱的碱性流动相下使用；而且可不经活化直接固相萃取[10-11]。实验结果表明：该固相萃取柱具有好的除去小极性干扰成分的效果，而且离子色谱分析进样量小(每次仅2.0 μL)，4×10 mm在线固相萃取柱的萃取容量在30 mg以上，连续进样分析500次以上，萃取柱上积累的干扰均不会超过萃取柱的容量；随着进样次数的增加，色谱系统的反压有明显升高后用甲醇冲洗固相萃取柱后即可恢复到初始压力。该在线固相萃取柱的使用简化了文献[8-9]中报道的样品前处理过程中的固相萃取操作，对离子色谱柱起到很好的保护作用。

考虑YC/T 251─2008方法样品前处理的样品萃取和过滤过程中需转移样品，操作麻烦。本研究中通过对样品萃取瓶的改进，设计了快速样品前处理方法。在该处理方法中样品萃取瓶由带密封圈的样品管(图1-a)和带固相萃取填料(C18)的内套管(图1-b)组成，准确称取样品置于带密封圈的样品管中，然后加入萃取液，把内套管卡在样品管的口部(筛板不接触到液面)防止超声萃取过程中萃取液溅出或超声波中的水溅入，把样品管放恒温超声水浴锅中超声萃取，萃取完后把内套管下压，萃取液就通过筛板和固相萃取填料进入到内套管中，并从内套管的细弯管中流出，从细弯管口收集经筛板过滤的萃取液，弃去最初的2～3 mL，然后用色谱进样瓶直接收集1.0～1.5 mL的萃取溶液，即可供离子色谱分析。

在改进的方法中，整个操作流程不需要转移样品，样品前处理过程得到了大大的简化。由于在震荡萃取前用内套管卡住样品杯的口部，有效防止了在震荡萃取过程中可能造成的萃取液溅出的风险。另外，按常规方法样品前处理操作时，在用针头过滤器过滤过程中，烟草细粉会堵塞过滤头，过滤速度较慢；而在改进的处理方法中，超声萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉到底下，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效地避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现。

2.2 色谱条件的选择

对于烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定，可选择的离子色谱柱有戴安CarboPac PA1、CarboPac PA10、CarboPac PA20柱以及万通METROSEPCARB-1等，其中CarboPac PA1色谱柱分离时间短，因此实验选用该色谱柱。CarboPac PA1色谱柱属于阴离子交换柱，一般采用氢氧化钠溶液为流动相，随流动相中氢氧化钠浓度增加，各成分在色谱柱上的保留时间缩短，但分离度下降；反之，随流动相中氢氧化钠浓度降低，各成分分离度有增加，但在色谱柱上的保留时间延长，结合时间和分离度综合考虑，本实验选择用0.2 mol/L的氢氧化钠溶液为流动相。另外，说明书中推荐流速为1.0 mL/min，适当加快流速可缩短分析时间，但流速过高会存在压力超过色谱系统反压设定上限的风险，流速在2.0 mL/min以下色谱系统压力均不会超压。考虑到随着使用次数的增加，色谱柱上微量杂质吸附会导致系统反压缓慢增加，因此本实验中选择流速为1.5 mL/min。

加大样品进样量有利于提高分析灵敏度，但进样量过大时色谱峰会稍有变宽而影响分离度；考虑到烟草样品中糖含量相对较高，进样2.0 μL时分析灵敏度已能满足实际样品分析的要求，因此本实验中选择进样体积为2.0 μL。

脉冲安培检测器是通过测量电化学活性物质在适当的施加电位下发生氧化或还原反应时所产生的电流变化，从而测定该物质的一种检测器。由于糖的分离是在碱性条件下完成，而脉冲安培检测器金电极的检测条件通常为碱性，金电极表面可为糖的电化学氧化反应提供反应环境，金电极检测和阴离子交换分离相互间具有良好的匹配性，非常适合用于糖类化合物的检测。因此本实验中参照胡静等[12]采用的脉冲安培检测器检测糖。

在选定实验条件下，标样和实际样品的色谱图见图2。从图2可以看出，葡萄糖、果糖和蔗糖均可达到基线分离，而且整个色谱分离时间只需10 min。

1.葡萄糖、2.果糖、3.蔗糖图2 标样(a)和烟草样品(b)色谱图

2.3 工作曲线与检出限

配制系列不同浓度的标准溶液，在选定色谱条件下进样1.0L，根据测得的峰面积A(单位为mV·s)对糖的浓度(mg/L)进行线性回归，得到回归方程。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样10L，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定定量限。从表1可以看出，各待测组分均具有很好的线性关系，线性范围能覆盖烟草样品中3种糖的实际含量。

表1 回归方程、相关系数、线性范围和检出限

2.4 精密度实验

取烟草样品在相同条件下平行测定7次(同批次处理)，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差，可得葡萄糖的RSD为2.0%、果糖的RSD为1.8%、蔗糖的RSD为2.3%，说明该方法的精密度良好。取相同烟草样品在不同时间内测定(每天测定1次，共7次)，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得葡萄糖的RSD为2.3%、果糖的RSD为2.2%、蔗糖的RSD为2.5%；说明在不同时间内测定，该方法的精密度仍然良好。

2.5 回收率实验

为验证方法的准确性，在2个烟草的样品中各加入相对于爆珠重量5.0、10.0、20.0 μg/g标样，分别进行萃取和HPLC分析，并根据测定量、加入量和原含量计算加标回收率。甲醛和乙醛的回收率见表3。从表3可以看出，3种糖的回收率均在93.2%～104.6%之间，说明该方法具有很高的回收率。

表2 方法回收率实验结果

2.6 样品分析结果

采用本方法与烟草行业标准方法YC/T 251─2008[7]对5个烟叶样品进行测定。由表3可知，采用本方法的测定结果与YC/T 251─2008的分析结果具有较好的一致性，说明该方法准确可靠。

表3 5种烟叶样品中糖的测定结果

3 结论

本研究针对目前烟草行业标准YC/T 251─2008测定糖时，其分析周期长、样品前处理操作麻烦，很难满足基因编辑工厂化育种工厂中产生的海量素材快速分析的需求。对在线固相萃取净化-离子色谱法测定烟草中的糖进行了研究。通过色谱柱和色谱条件的优化，每个样品的色谱分析时间可缩短到10 min。通过在离子交换柱前增加反向树脂在线净化柱，可有效地在线除去样品萃取液中的小极性干扰成分，避免了这些成分污染色谱柱而影响分析结果。为了进一步简化样品前处理，笔者还通过自主设计的样品萃取瓶，可不经样品转移就可完成样品的萃取和萃取液的过滤，使样品前处理周期也大大缩短。改进方法和目前行业标准相比，日样品分析量可提高3倍以上；而且该方法的精密度、回收率均可满足烟草样品分析的需求。通过实际样品分析结果和行业标准方法进行对比，3种糖的分析结果均和烟草行业标准的测定结果相符合。该方法的建立为基因编辑素材化学筛选提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。