柑橘四倍体田间化学诱导技术研究

万水林,刘召亮,胡钟东,闫承璞, DUAN Xian-ming,王雨亭

(1.江西省农业科学院 园艺研究所,江西 南昌 330200;2. Bay Food Tech. CA, 95129, USA)

当前我国柑橘生产中,大部分栽培品种有核,不受消费者欢迎;有些柑橘主栽品种因品质较差,在市场上缺乏竞争力;还有一些地方良种在国内外新品种不断出现的今天,其传统优势逐渐失去,优势不再。因此对柑橘有核品种进行无核化改良,提升栽培品种和地方良种的品质,开展柑橘倍性育种很有必要。而要进行倍性育种,首先必须开展多倍体的诱导研究,从而为柑橘倍性杂交提供四倍体亲本。四倍体的产生方式包括自然发生和人工诱导两种。陈全友等在苏北灌云县发现了1株自然四倍体的枳幼树[1],这种自然四倍体的发生概率极低,一般均从实生种子中筛选获得。美国农业部通过对种子幼苗外部形态特征的鉴别,获得了多个柑橘种类的同源四倍体[2];借助流式细胞仪,西班牙从苗床中筛选出30多株自发性同源四倍体[3];华中农业大学根据幼苗形态观察结合流式细胞仪检测,从枳等10个砧木类型的实生种子幼苗中发现了部分四倍体[4],从早金甜橙等9个品种的实生后代中筛选出了部分同、异源四倍体和同、异源三倍体[5]。人工诱导为获得四倍体的主要方式,陈大成等(1985)采用田间活体诱导方式,用秋水仙素处理柑桔栽培品种嫁接苗,获得了同源四倍体,并在其中发现一个有希望作为经济栽培的四倍体柑桔类型——同源四倍体十月桔[6]。由于进行活体诱导时无法保证细胞的分裂同步,因此活体诱导较难得到纯合四倍体植株,大多为嵌合体,且诱导率低。随着生物技术的发展,多倍体大多是通过组织培养、生物技术等离体培养方式获得的,例如：刘继红等采用电融合方法诱导澳洲指橘,获得了柑橘属间四倍体体细胞杂种[7];洪柳等通过组培方法对椪柑种子进行培养,获得了7株四倍体植株[8];美国Grosser等[9]、Viloria等[10]先后采用原生质体融合技术,获得了柑橘体细胞杂种;西班牙Pablo Aleza等采用组培砧苗,用微芽嫁接结合秋水仙素诱导处理获得了柑橘四倍体[11];何建等用胺磺灵浸泡椪柑茎段,获得了椪柑四倍体[12]。

目前,对柑橘多倍体的诱导研究大都集中在组织培养等离体诱导方法上,该方法在实验室内进行,易于控制,诱导率较高；而对田间活体诱导研究较少。但采用田间活体诱导方式,操作简单,无需炼苗,诱导成功后可快速投入应用。由于柑橘种类较多,不同的柑橘种类之间树势、枝梢和芽的外部形态及组织结构特征均有较大差异,因而对所需的诱导药剂及其使用浓度等可能存在差别,因此,我们开展了柑橘四倍体田间化学诱导技术的试验研究,以便为柑橘田间多倍体的高效诱导提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为江西目前栽培较多的柑橘品种,包括南丰蜜橘、新余蜜橘、椪柑、金沙柚以及文旦柚。试验在江西省农业科学院园艺研究所试验基地进行。

1.2 试验方法

1.2.1 诱导药剂 选用目前对植物四倍体诱导效果最佳的秋水仙素(Colchicine)[100 mg/支,由生工生物工程(上海)股份有限公司生产]、氨磺乐灵(Oryzalin)(100 mg/支,由美国Sigma-Alorich公司生产)、氟乐灵(Trifluralin)(250 mg/支,由美国Sigma-Alorich公司生产)。

1.2.2 药剂配制 将秋水仙素直接用水溶解,按要求配制成0.025%～0.200%的溶液；配制好后,再加入1%DMSO(二甲基亚砜),待用。在室温下将0.1 g氨磺乐灵溶于0.5 mL丙酮溶剂,溶解过程中加盖防挥发；再加入1 mL乙醇,混匀后再加入0.2 mL吐温-20,充分混合；最后用丙二醇定容至2 mL,配制成5%的氨磺乐灵母液；试验前再配制成各种所需的浓度。将0.1 g氟乐灵用0.4 mL二甲基亚砜溶解后,再用60 ℃左右的温水稀释至所需的不同浓度。

1.2.3 处理方法 在2015年,以0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的秋水仙素进行新余蜜橘活体芽的诱导效果比较;不同柑橘品种间的诱导效果比较统一采用0.15%的秋水仙素。在2016年，以0.025%、0.05%、0.075%和0.10%的秋水仙素进行新余蜜橘诱导效果的比较;不同柑橘品种间的诱导效果比较统一采用0.05%的秋水仙素溶液。在2017年,采用0.10%的处理浓度,进行了同一浓度条件下不同药剂田间诱导的比较试验。

活体芽诱导处理方法:在2015年3月春芽发芽前,选枝条中上部腋芽,用棉球饱和吸取事先配制好的处理溶液,置于已剪去叶片的腋芽上,然后用parafilm封口膜将棉球和腋芽密封包裹,做好标记,10 d后,去掉包裹。2016年的试验则在2015年试验研究的基础上进行了改进,除降低了秋水仙素的使用浓度外,为保持处理部位相对稳定的温度环境,保持药剂的稳定性,在用封口膜包好后,外部再用黑色胶布包裹。2017年的处理方法同2016年。

1.3 倍性检测

在处理1个月后,检查处理芽的发芽情况。在处理2个月后,用德国Partec公司生产的CyFlow PA型流式细胞仪检测叶片的染色体倍性。

2 结果与分析

2.1 不同浓度秋水仙素处理对新余蜜橘发芽率的影响

用不同浓度的秋水仙素诱导新余蜜橘活体芽时,秋水仙素对芽的正常萌发有一定程度的影响,结果见图1。发现以0.05%的秋水仙素处理时发芽率最高,为81.20%;用0.20%的秋水仙素处理时发芽率最低,为25.00%。随着秋水仙素使用浓度的提高,柑橘的发芽率明显下降,说明秋水仙素对柑橘芽的萌发有抑制作用,而且随着秋水仙素使用浓度的增加,抑制作用增强。

图1 不同浓度秋水仙素对新余蜜橘发芽率的影响(2015年)

2.2 不同浓度秋水仙素对新余蜜橘四倍体的诱导效果

连续两年的试验结果(表1和图2)表明,对新余蜜橘活体芽四倍体诱导效果最佳的秋水仙素处理浓度为0.10%，在该浓度条件下,2015年新余蜜橘四倍体的诱导率达13.43%,2016年新余蜜橘四倍体的诱导率达14.29%。秋水仙素使用浓度过高或过低均会降低四倍体的诱导效果。

2.3 秋水仙素对不同柑橘品种的四倍体诱导效果

2015年诱导比较试验结果显示,经秋水仙素处理后,不同柑橘品种间的发芽率和四倍体的诱导效果差异均较大,以新余蜜橘的发芽率最高,为36.00%;以南丰蜜橘的四倍体发生率最高,为5.00%(表2)。

表1 不同浓度秋水仙素对新余蜜橘四倍体诱导效果的影响

注：表头中的百分数为秋水仙素使用浓度。4X指四倍体，2X指二倍体，下同。

图2 流式细胞仪倍性检测结果(左图为二倍体;右图为四倍体)表2 0.15%秋水仙素对不同柑橘品种四倍体的诱导效果(2015年)

项目新余蜜橘南丰蜜橘温州蜜柑文旦柚处理芽数/个50404927发芽数/个1811112发芽率/%36.0027.5022.457.414X数/个12104X发生率/%2.005.002.040.00

在2015年的试验中,采用的秋水仙素处理浓度为0.15%,四倍体诱导率较低,最高的南丰蜜橘四倍体的诱导率也仅为5.00%。因此，在2016年的试验中降低秋水仙素的使用浓度至0.05%,结果(表3)表明：除新余蜜橘四倍体的诱导率较低外,其它柑橘品种的诱导率均较高,其中南丰蜜橘的诱导率高达42.86%；另外，秋水仙素处理浓度降低后,各柑橘品种的发芽率未受到药剂影响,均达到100%。

表3 0.05%秋水仙素对不同柑橘品种四倍体的诱导效果(2016年)

2.4 不同处理药剂对柑橘四倍体的诱导效果

采用秋水仙素、氨磺乐灵和氟乐灵分别对新余蜜橘进行田间四倍体诱导试验,处理浓度均采用0.10%,将试验效果列于表4。结果表明：在3种诱导药剂中,对新余蜜橘四倍体诱导效果最佳的药剂为秋水仙素,诱导率为30%；其次为氨磺乐灵,诱导率为7.69%；而氟乐灵无诱导效果。

表4 不同处理药剂对柑橘四倍体的诱导效果(2017年)

3 讨论

秋水仙素已被证实是诱导植物多倍体的最为有效的药剂,它对细胞分裂活跃状态的组织具有有效的刺激作用,可使分生组织的染色体加倍,所以它常被用于处理种子、子叶、生长点等部位[13-14]。前人研究表明,组织培养等离体方式的多倍体诱导效果与使用的具体诱导剂的浓度和处理时间以及植物种类、器官和温度等有关,使用浓度过高、处理时间过长会使植物受到伤害；而浓度过低、时间过短又起不到很好的诱导效果[15-16]。在本研究中,所选用的柑橘材料为刚萌发的腋芽,是因为其细胞分裂旺盛,有利于对药剂的吸收。在2015年试验中由于使用的秋水仙素浓度过高,明显影响了柑橘的发芽。在2016年,降低秋水仙素的使用浓度至0.05%,结果发芽率均达到100%,而且四倍体的诱导率也得到了极大的提高。

用秋水仙素处理植株时,还要注意对温度条件的控制,低温会阻碍细胞分裂,过高的温度则会使秋水仙素对细胞的损害加大,同时也会加速秋水仙素的变性。在2016年试验中,用封口膜密封后,外部再用黑色胶布包裹,有效防止了阳光直射引起的温度过高,避免或减轻了药剂伤害,经秋水仙素处理后各柑橘品种的发芽率均未受到任何影响。

除草剂氨磺乐灵、氟乐灵具有低的毒性和良好的多倍体诱导效果，在多种植物上已得到应用[17-19]；用氨磺乐灵也成功诱导离体柑橘外植体获得了四倍体材料[11-12]。但本研究发现,氨磺乐灵对柑橘田间活体芽多倍体的诱导效果不如秋水仙素,这与氨磺乐灵在组织培养条件下的诱导结果[11,20]类似。

前人的相关研究表明,多倍体诱导中的嵌合体严重是多倍体育种中的难点[21-22]。Aleza用0.1%的秋水仙素和0.1%的氨磺乐灵分别对离体克里曼丁等橘类的腋芽诱导后进行微芽嫁接,四倍体的诱导率分别为15%和33%；秋水仙素诱导的四倍体存在一定比例的嵌合体,但产生的四倍体较氨磺乐灵诱导的生长更快[23]。而我们的研究发现,采用相应的处理技术后,嵌合体的发生率并不高,2015年只发现有极少量嵌合体发生,2016年则未检测出嵌合体,均为纯四倍体,可能与选择了适宜的诱导时期和创造了有利的诱导条件有关。

4 结论

本研究结果表明：对柑橘田间活体芽诱导四倍体效果最佳的药剂为秋水仙素,其适宜的处理浓度为0.10%；氨磺乐灵和氟乐灵的诱导效果较差;秋水仙素对不同柑橘品种发芽率和四倍体诱导率的影响均存在较大的差异,以新余蜜橘的发芽率最高,以南丰蜜橘的四倍体诱导率最高;进行田间活体诱导时,辅以适宜的技术措施,可大大提高发芽率,并降低嵌合率。