添加辣椒对酸鱼发酵进程和理化指标的影响

夏秀东,单成俊,刘小莉,吴 寒,王 英,张丽霞,黄自苏,周剑忠

(江苏省农业科学院 农产品加工研究所,江苏 南京 210014)

有着千年历史的酸鱼是在淡水鱼中加入较低量的食盐和一定量的香辛料辣椒后经密闭自然发酵而成的传统发酵制品[1]。酸鱼不仅酸香浓郁、风味独特、回味醇厚、贮藏期长,而且营养丰富，蛋白含量高，富含多种游离氨基酸,而脂肪含量低，因此深受人们的青睐，在我国、日本及东南亚等地具有很大的需求市场[2]。自然发酵微生物对发酵产品的感官和营养特性以及安全性起着重要的作用[3]。因此,发酵食品中微生物菌落的演替过程及其对发酵产品质量及安全的影响也成为当前的研究热点[4]。据2015年联合国粮农组织(FAO)的调查结果，全球每年对辣椒的消费量达到350万t,辣椒是世界上消费量最大的调味品之一[5]。辣椒具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、抗糖尿病、减肥、治疗胃病等作用，因此它被广泛用于食品保鲜和医疗保健领域[5]。辣椒占酸鱼产品总重量的1%～2%[6]；辣椒的添加在赋予酸鱼独特的香辛味的同时也会影响酸鱼发酵过程中微生物群落的演替和代谢途径的变化,进而影响酸鱼产品的风味和品质，但其具体作用机制尚不清楚。

在高通量测序技术普及之前,传统的微生物分离培养技术和主要基于rRNA测序的PCR-DGGE技术在探索传统发酵食品中微生物群落演替中发挥了重要的作用。随着高通量测序技术的广泛应用,人们发现这些技术存在着获取信息不全面、重复性差和灵敏度低等缺陷[7]。而基于高通量测序的宏基因组学分析技术则克服了这些缺陷。借由宏基因组测序技术,大量不可培养的微生物得以被发现，新的功能基因或新基因簇得以被认知,这极大地促进了对微生物群落组成、演替及其互作的认识,可以对群落中微生物的代谢特征和代谢途径进行预测。本研究利用生化分析方法和高通量测序技术分析了辣椒在酸鱼发酵过程中对pH值、挥发性盐基氮(TVBN)和细菌演替过程的影响,以期为深入研究辣椒对发酵酸鱼风味和品质的影响提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

草鱼购自江苏省南京市玄武区孝陵卫菜市场。

PCA (plate count agar)琼脂培养基(上海盛思生化科技有限公司); QIAGEN DNA Mini-Kit (QIAGEN, Hilden, Germany); Illumina Hiseq测序平台(Illumina公司); HJ-3型数显恒温磁力搅拌器(国华电器有限公司); SX-500-TOMy高压灭菌锅(日本Tomy公司); SIGMA 3K15离心机(美国Sigma公司); THZ-C-1型台式全温振荡器(苏州培英实验设备有限公司); CRh-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司); Sw-CJ-K型双人单面净化工作台(苏州华宏净化技术有限公司); JT-B均质器(河南兄弟仪器设备有限公司);便携式pH计(美国Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 酸鱼的制作和取样 参照Zeng等[8]的实验方法,取新鲜草鱼,去鳞除内脏,用清水洗净后将其分割成长度5 cm左右的鱼块,按照草鱼75%、食盐3%、蔗糖2%、辣椒粉2%(不加辣椒粉的酸鱼作为对照)、茴香0.2%、肉桂0.1%、花椒0.2%的比例添加食盐和各种香辛料,混合均匀后置冰箱中腌制24 h,晒制2 d以除去部分水分；然后加入17.5%的炒制玉米粉,并在鱼肚中塞入部分炒制玉米粉,在陶瓷坛的底部铺上部分炒制玉米粉作为底料；按鱼层铺辅料,压紧,在顶部铺上一层辅料后再铺上一层塑料,加盖封严,自然发酵50 d。分别在发酵第0、3、5、10、15、20、25、30、40、50天取酸鱼样品进行分析。

1.2.2 平板计数及细菌分离 参照夏秀东等[9]的实验方法,称取酸鱼样品25 g放于灭菌匀浆杯中,加入225 mL 0.85%无菌生理盐水,充分研磨后转移到灭菌的500 mL三角瓶中,以200 r/min振摇30 min,静置15 min,自然沉淀；用0.85%生理盐水对上清液进行10倍梯度稀释；取0.1 mL的稀释液均匀涂抹在PCA培养基上,培养1～2 d,记录菌落总数,每个样品做3个平行实验。

1.2.3 TVBN值的测定 具体方法参照SC/T 3032—2007水产品中挥发性盐基氮的测定方法。

1.2.4 pH值的测定 准确称取10 g样品，用剪刀剪成小块后放入均质机中,加90 mL去离子水,用均质机充分均质30 s，然后在室温下放置30 min,用数显pH计测量pH值。

1.2.5 酸鱼样品中总DNA的提取和宏基因组分析 参照Hong等[10]的实验方法,取10 g酸鱼样品，加入90 mL生理盐水(0.85% NaCl)中，于高速匀浆机中匀浆1 min,然后用干净的纱布过滤样品,滤掉较大的鱼肉组织。用QIAGEN DNA Mini-Kit提取样品的宏基因组DNA。宏基因组DNA经检验合格后片段化构建PE文库,利用Illumina Hiseq测序平台对样品的基因组进行测序,得到原始数据。

对原始数据进行质量控制之后,用Usearch软件对数据进行去嵌合体和聚类的操作。在进行Usearch聚类时,先将read按照丰度从大到小排序,通过97%相似度的标准聚类,得到OTU (Operational Taxonomic Unit),每个OTU被认为可代表1个物种。在聚类过程中利用Denovo方法去除嵌合体(chimeras)。接下来对每个样品的tags进行随机抽平处理,并提取对应的OTU序列。然后使用Qiime软件,做alpha多样性指数的稀释曲线,根据稀释曲线选择合理的抽平参数；利用Qiime软件对得到的抽平后的OTU进行分析,首先从OTU中分别提取1条read作为代表序列,使用Uclust方法,将该代表序列与16S数据库比对,从而对每个OTU进行物种分类。归类后,根据每个OTU中序列的条数,得到OTU的丰度表,最后根据该OTU丰度表进行后续分析。

1.2.6 数据处理 用Origin 9.1对实验数据作图。通过Qiime软件,采用迭代算法,分别在加权物种分类丰度信息和不加权物种分类丰度信息的情况下进行差异计算,得到最终的统计分析结果表并做出PCA展示图。

2 结果与分析

2.1 酸鱼发酵过程中微生物菌落总数和pH值的变化情况

发酵酸鱼样品分为添加辣椒和不添加辣椒两组。图1A结果表明：添加辣椒组的菌落总数在发酵的前25 d内均低于未添加辣椒组；从第25天开始添加辣椒组的微生物菌落总数与未添加辣椒组无显著差异。图1B结果表明：添加辣椒组的pH值在发酵的前30 d内均低于未添加辣椒组；从第25天开始添加辣椒组的pH值与未添加辣椒组无显著差异。以上结果说明：在发酵前期,酸鱼中添加辣椒可能抑制了其中一些微生物的生长,同时影响了酸性物质的产生；而到了发酵中后期,一些能够耐受辣椒抑菌物质的微生物迅速生长,使得添加辣椒的酸鱼的微生物总数迅速增加,同时产生大量的酸性物质，从而降低了酸鱼的pH值。

图1 酸鱼发酵过程中菌落总数和pH值的变化

2.2 添加辣椒对挥发性盐基氮(TVBN)产生的影响

TVBN是微生物分解蛋白质、氨基酸等含氮化合物产生的氨、生物胺等碱性代谢产物的总称,是评价食品品质最常用的指标之一。由图2可知,添加辣椒组的TVBN含量在酸鱼发酵过程中一直低于未添加辣椒组的。这可能是由于添加辣椒抑制了一些产TVBN腐败菌的生长。这说明,添加辣椒不仅可使传统发酵酸鱼拥有香辛味和保健功能,而且还能提高发酵酸鱼产品的安全性和质量。

图2 酸鱼发酵过程中挥发性盐基氮的变化情况

2.3 添加辣椒对酸鱼发酵过程中细菌演替过程的影响

表1中的OTUs和Chao1数据显示,添加辣椒会增加酸鱼的细菌多样性。在发酵前期,酸鱼中的微生物多样性都呈现快速下降的趋势,这是由酸鱼携带细菌间竞争性抑制和一些细菌不能适应因氧气耗竭而形成的微氧环境造成的。但是,添加辣椒的酸鱼的细菌多样性下降较未添加辣椒的酸鱼慢。在发酵中后期酸鱼中的细菌多样性基本稳定。值得注意的是,到了发酵后期,添加辣椒的酸鱼的细菌多样性低于未添加辣椒的酸鱼的,这可能是由辣椒中的抑菌物质引起的。

图3结果表明,在酸鱼发酵过程中葡萄球菌(Staphylococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)和魏斯氏菌(Weissella)逐渐成为优势菌群,但是添加辣椒的酸鱼中这3种细菌成为优势菌群的时间晚于未添加辣椒的酸鱼的,这一结果与表1结果一致。同时,值得注意的是魏斯氏菌在未添加辣椒的酸鱼中数量较少,葡萄球菌和乳杆菌的数量较多,但在添加辣椒的酸鱼中含有大量的魏斯氏菌,而葡萄球菌和乳杆菌的数量较少。

图4主成分分析(PCA)结果显示,在整个发酵过程中,两种酸鱼的细菌群落沿着相似的路线分配到PC1和PC2区域,这说明,在这两种酸鱼发酵过程中的细菌群落有着相似的演替过程。然而,添加辣椒的酸鱼中细菌群落数据点在发酵前期移动较慢,说明辣椒减缓了酸鱼的前期发酵过程。除了发酵初期外,葡萄球菌和乳杆菌是这两种酸鱼中均具有较大影响力的细菌。葡萄球菌是发酵前期影响力最大的细菌,其较强的蛋白酶活性可强力降解鱼肉中的蛋白质,为其他微生物的生长提供充足的氮源。乳杆菌是发酵后期最有影响力的细菌。魏斯氏菌在未添加辣椒的酸鱼中的影响力可以忽略,但是其影响力在添加辣椒的酸鱼的发酵中期逐渐增加,同时葡萄球菌和乳杆菌在这一阶段的影响力略微下降。这一结果也支持了添加辣椒会延长酸鱼发酵前期的时间,同时使魏斯氏菌数量在酸鱼发酵过程中持续增加而使葡萄球菌和乳杆菌数量相对减少的结论。

表1 发酵酸鱼样品细菌多样性测序结果

A:未添加辣椒粉;B:添加辣椒粉。图3 酸鱼发酵过程中细菌丰度的变化情况

A:未添加辣椒粉;B:添加辣椒粉。图4 酸鱼发酵过程中细菌群落主成分分析结果

3 讨论

传统食品发酵体系是由多种微生物构成的独特微生态环境,其中的微生物被称为发酵食品的“灵魂”,与发酵制品的品质和风味形成有直接关系[11-12]。这些食物中的微生物群落多样性和从中分离益生菌成为现在的研究热点[4]。

辣椒居世界五大辛辣调味品之首,食辣范围涉及世界60%的国家,食辣人口超过30亿[13]。辣椒中含有丰富的维生素C、抗坏血酸、胡萝卜素、辣椒红素、酚类、辣椒素、肉桂酸等物质,使辣椒不仅具有独特的香气、辛辣味,而且具有抗菌和防腐的作用[5]。多项研究表明辣椒具有广谱的抑菌效果,对蜡性芽孢杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌、腐败菌以及酵母菌和霉菌均有一定的抑制效果[14-23]。这可能就是添加辣椒造成酸鱼发酵前期菌落总数增加和pH值降低值减慢以及TVBN始终低于未添加辣椒的发酵酸鱼的原因。

目前,国内外对辣椒在传统发酵食品中对微生物演替及其代谢产物影响的研究非常少。Jeong和Ono等利用分析样品总DNA中16S rRNA的方法[24-25]分别就辣椒在传统发酵酱菜和发酵韩国泡菜生产过程中对微生物的演替及其代谢产物的影响进行了研究。Ono等发现添加辣椒可促进乳酸菌成为发酵酱菜的优势细菌和乳酸的积累,尤其是戊糖片球菌和魏斯氏菌,进而抑制金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌等主要致病菌的生长,大大缩短前乳酸发酵阶段。Jeong等在发酵韩国泡菜中的研究结果与Ono等不同,他们发现添加辣椒会显著延长发酵初期的时间；与未添加辣椒的泡菜相比,添加辣椒的泡菜在发酵初期菌落多样性下降较慢,而在发酵的中后期菌落多样性较低,且魏斯氏菌的相对数量显著增加。这一结果与本研究的结果相似。

4 结论

添加辣椒可显著影响酸鱼的发酵进程,抑制发酵前期菌落总数的增加、pH值的降低和整个发酵过程中TVBN的生成,这可能是由于辣椒中的活性成分影响了酸鱼发酵过程中细菌的演替过程。但是对于辣椒中的何种物质及其如何影响酸鱼的发酵进程仍需做进一步的研究。