核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析

高向倩，李忆林，贾彩霞，李大培，杨玉婷，杨桂燕

（1.西北农林科技大学 林学院 山阳核桃板栗试验示范站，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 林学院 陕西省经济植物资源开发利用重点实验室，陕西 杨凌712100）

谷胱甘肽转移酶（GSTs）是一个多功能的二聚体酶超家族，具有解毒、清除细胞内活性氧等功能［1］。在植物中，GSTs根据其功能和序列等特征被分为8个亚家族：alpha，mu，pi，sigma，theta，kappa，zeta 和线粒体（microsomal）GSTs［1－3］。 目前， 很多植物中的GST基因被陆续克隆［4-5］， 并进行功能研究， 发现来自不同植物的GST同源基因或相同植株的不同GST基因，其功能具有一定差异。大多数GSTs基因具有响应逆境胁迫的功能。如前期研究发现，柽柳Tamarix hispida的zeta家族基因ThGSTZ1能被氯化钠，聚乙二醇（PEG 6000），脱落酸（ABA）和甲基紫精（MV）等胁迫调控，过量表达情况下能提高转基因株系抵抗盐、旱、MV及ABA等胁迫的能力［6－7］。核桃Juglans regia的JrGSTTau1基因也能响应不同逆境刺激，过量表达能改善植株应对低温胁迫的能力［8］。在羽衣甘蓝Brassica oleracea中分离获得65个GST基因，其中BoGSTU19，BoGSTU24，BoGSTF10能被冷胁迫强诱导，推测它们与冷胁迫响应具有重要关系［9］。水稻Oryza sativa OsGSTl2转基因拟南芥Arabidopsis thaliana表现出较高的重金属耐受力［10］。这些研究表明：GST基因在植物响应逆境应答及调节中具有多方面的作用，因此具有重要的研究价值。GST家族成员众多，目前对GST基因的研究主要集中在草本植物，对木本植物GST基因的研究较少，特别是经济干果核桃鲜见报道。核桃属多年生落叶乔木，是中国主要经济树种之一。近年来全球环境的变化，环境因子特别是西北地区越冬入春出现的 “倒春寒”及夏秋核桃成熟期严重的高温干旱等气候现象，严重制约了核桃产业的发展。因此，筛选核桃逆境响应重要基因，研究其逆境响应功能机制，将对了解核桃的逆境适应机制具有指导作用。本研究从核桃中鉴定获得1条GST基因JrGSTU23，通过生物信息及定量表达分析其生物学功能，以期为核桃抗逆响应研究提供候选基因。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

选取培养于相同条件下的2年生 ‘香玲’ ‘Xiangling’核桃嫁接苗用作研究材料。处理包括非生物胁迫［100 g·kg-1聚乙二醇（PEG 6000）， 0.3 mol·L－1氯化钠、 低温 6 ℃］和激素处理［0.1 mmol·L－1脱落酸（ABA）］， 100.0 mg·L－1茉莉酸（MeJA）及 2.0 mg·L－1水杨酸（SA）。 分别在 0， 3， 6， 12， 24， 48 h 取样，以0 h正常浇水作为对照，重复3次·处理－1。分别收集各处理后的根和叶，用液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

1.2 JrGSTU23基因的克隆与分析

以 “glutathione transferase”为关键词在 ‘香玲’核桃转录组数据中查找GST基因，经BLAST比对选取其中1条GST基因（命名为JrGSTU23）进行分析。用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定JrGSTU23基因开放读码框（ORF），再根据ORF两端序列设计引物JrGSTU23-F和JrGSTU23-R（表1），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。产物经回收纯化后与pMD-18-T载体连接并转化大肠埃希菌Escherichia coliDH5ɑ感受态细胞。挑取阳性克隆扩大培养进行菌液PCR验证，对获得目的片段的克隆测序。利用Expasy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对确认的JrGSTU23基因序列特征进行分析。利用BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）进行序列同源性搜索；利用Clustal 3.0软件对不同物种的GST蛋白进行多序列比对和进化分析。使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析该基因启动子中含有的顺式作用元件。利用Expasy中Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构模型。

表1 研究所用引物Table 1 The used primers

1.3 JrGSTU23的表达分析

各样品总核糖核酸（RNA）采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取［8］，RNA经DNA消化酶处理后采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（CWBIO，康为世纪，中国）反转录为cDNA，稀释10倍后用作实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的模板。qRT-PCR参照SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）进行，内参基因为核桃 18S rRNA（HE574850）基因［10］。JrGSTU23定量引物为 DL-F和 DL-R（表1）。 定量反应仪器为Applied Biosystems生产的Step OneTMReal-Time PCR System。反应程序为：94℃预变性30 s；94℃变性12 s，60℃退火45 s，72℃延伸 45 s，45个循环；81℃读板 1 s， 重复3次·样品－1。 采用 2-ΔΔCt法对定量结果进行相对分析［11］，所有表达值均做了以2为底的对数转化。

2 结果与分析

2.1 JrGSTU23全长cDNA序列分析

通过查找核桃转录组数据获得1条GST基因，根据获得的cDNA序列设计引物JrGSTU23-F/R进行PCR验证，经分析发现该基因ORF长684 bp，拟推导的蛋白分子量为25.89 kDa，含有氨基酸数为227，理论等电点为5.20。BLAST分析发现：该基因与核桃转录组中的GST23基因相同。保守结构域分析发现：该蛋白具有GST-Tau保守域（图1），表明该蛋白属于GST氧硫还蛋白亚家族（thioredoxin-line superfamily，Thi），因此命名为JrGSTU23（GeneBank登录号：MG356784）。经美国生物技术信息中心（NCBI）同源搜索获得相似蛋白，并进行进化分析，发现JrGSTU23蛋白与香蕉Musa accuminata，毛果杨Populus trichocarpa等的进化关系较近（图2）。通过Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构如图3所示。

2.2 JrGSTU23启动子分析

以JrGSTU23在NCBI数据库中进行同源搜索，发现其与 ‘强特勒’核桃的GST序列（XM_018974105.1）一致。因此，分析XM_018974105.1序列起始密码子上游2 000 bp的DNA序列作为基因启动子，并对其顺式作用元件进行分析，为预测JrGSTU23基因的功能及可能调控机制提供参考依据。PlantCARE预测结果显示，JrGSTU23启动子包含多个与逆境响应及激素调控相关的顺式作用元件，如热胁迫响应元件（HSE），干旱响应元件（MBS），茉莉酸响应元件（CGTCA-motif），水杨酸响应元件（TCA-element）等（表 2）。

2.3 外源激素胁迫对JrGSTU23表达的影响

对试材分别进行ABA，MeJA，SA等激素处理。qRT-PCR实验发现：JrGSTU23能被这些激素明显诱导，但在根和叶的表达趋势不同（图4）。在叶中，ABA处理3～6 h被抑制，24 h达最大表达水平（2.85）；MeJA胁迫下与ABA相反，随着胁迫时间延长，JrGSTU23的表达水平逐渐下降，在24 h被抑制（－0.98）；SA胁迫3～6 h也被抑制，在24 h达最大值4.13，但其最低值出现在3 h，为－0.01。在根中，JrGSTU23在ABA胁迫下的最大和最小转录水平分别出现在12和24 h，分别为4.35和2.74；MeJA处理下，该基因的最大和最小表达量分别为7.24（12 h）和2.73（3 h）；而在SA胁迫下，JrGSTU23的表达随胁迫时间延长而增强，最大值为4.57倍（24 h）。表明JrGSTU23基因能不同程度响应ABA，Me-JA，SA的胁迫，并表现出组织特异性，但其具体的响应机制可能不同。

2.4 不同非生物胁迫对JrGSTU23基因表达的影响

qRT-PCR结果显示：JrGSTU23能被氯化钠，聚乙二醇（PEG 6000），6℃等不同胁迫明显诱导，且在大多数时间点下的表达差异显著（图4）。氯化钠胁迫下，JrGSTU23在根和叶中的表达趋势相似，均随着胁迫时间的延长表达增高，在胁迫24 h达最大表达水平，分别为2.49和4.11。但除3 h外，其他处理点该基因在根中的表达水平高于在叶中的表达。PEG 6000模拟干旱胁迫3～12 h，JrGSTU23在叶中的表达被抑制，24 h被诱导为1.76；在根中的表达趋势与氯化钠胁迫相似，随着胁迫时间延长而增大，且在24 h达最高水平，但表达量低于氯化钠胁迫。表明JrGSTU23应对氯化钠和干旱胁迫的响应机制可能相似，但JrGSTU23对盐胁迫可能更为敏感。低温胁迫下，JrGSTU23在叶中的表达在6 h（1.22）和24 h（2.30）出现2个高峰；在根中，其表达趋势与氯化钠和干旱胁迫相似，随着胁迫时间延长而升高，在24 h 达最大值（3.06）。

图1 JrGSTU23蛋白与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析Figure 1 Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species

图2 JrGSTU23蛋白与其他物种相似蛋白氨基酸序列的系统进化树分析Figure 2 Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species

图3 JrGSTU23蛋白三维结构预测模型Figure 3 Predicted 3D structure model of protein JrGSTU23

表2 PlantCARE预测JrGSTU23启动子区顺式作用元件Table 2 Cis-acting regulatory elements in JrGSTU23 promoter predicted by PlantCARE

图4 JrGSTU23基因在不同胁迫处理下的表达水平Figure 4 Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses

3 讨论

GSTs是植物响应逆境的重要基因，在植物解毒等方面具有重要作用。其中，含有Tau保守结构域的GST亚家族基因，参与植物众多的逆境响应。核桃作为中国西北地区扶贫攻坚项目的重要经济树种，在推动区域经济发展上具有重要作用。核桃产业的健康快速发展与核桃产量和质量息息相关。但气候等环境因子严重制约了中国核桃产业的发展，因此，选育抗逆优良核桃品种，掌握核桃抗逆适应机制，对深入了解核桃的适应性具有重要指导作用。本研究从 ‘香玲’核桃中克隆获得1条Tau家族的GST基因（JrGSTU23），经进化分析发现该基因与来自水稻、香蕉、毛果杨、大豆Glycine max等物种的Tau家族基因具有较近的亲缘关系，推测其可能与这些蛋白具有相似或相近的功能。如，水稻Osgstu4和Osgstu3能迅速被抗氧化剂和过氧化氢诱导，表明Osgstu4和Osgstu3的应答反应涉及氧化还原反应［12］。大豆GmGSTU2-2是严格的渗透胁迫型响应基因，参与植物胁迫反应中的催化和调节功能网络［13］。毛果杨的GSTU16和GSTU45能被三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotoluene）诱导［14］。因此，推测JrGSTU23与逆境应答具有重要关系。

顺式作用元件一般由5～20个碱基对组成，是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列［15］。海蓬子Salicornia brachiata的一个Tau类GST基因的上游1 023 bp启动子包含有非生物胁迫响应相关的ABA响应元件（ABRE），干旱响应基因rd22识别位点（MYB），结节特意表达元件（NOD），光响应表达元件（GATA），光调控表达元件（GT1）及激素、病害和损伤等相关的顺式作用元件，参与了该基因响应氯化钠和渗透胁迫的表达调控［16］。玉米Zea mays的ZmCIPK10和ZmZIP71基因启动子序列中含有ABA，SA，赤霉素（GA），低温等相关的顺式作用元件，在氯化钠、干旱、低温胁迫下，ZmCIPK10和ZmZIP71的表达量上升，表明其参与了玉米的逆境响应［17－18］。本研究发现：JrGSTU23基因启动子含有丰富的顺式作用元件，如玉米素代谢、种子调控、分生组织激活、胚乳表达以及干旱胁迫、热胁迫、防卫、MeJA和SA等响应相关的元件（表2）。由此可推测，JrGSTU23可能参与植物生长发育及逆境响应过程，具有深入研究的价值。

GSTs基因响应逆境具有组织表达特异性。本研究发现的JrGSTU23基因在不同激素（SA，MeJA，ABA）及不同逆境（氯化钠、干旱、低温）下在根和叶中能被不同程度地诱导表达，体现了一定的组织表达特异性和逆境响应特异性。这与其他物种的Tau家族GST基因的逆境响应表达具有一定的相似性。如从香蕉克隆获得的5个GST基因（MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3，MaGSTF1，MaGSTL1）的表达具有组织特异性，在盐、干旱、冷等胁迫下Tau亚家族的MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3的表达受盐、干旱、冷诱导更为明显，而MaGSTF1和MaGSTL1更受信号分子影响［19］，预测这些GST基因对不同逆境的响应功能具有差异。盐胁迫下，番茄Solanum lycopersicum的SlGSTU23和SlGSTU26基因在叶中被上调表达［20］，推测这些GST基因在不同逆境下的具体功能可能不同。JrGSTTau1在低温胁迫下也表现出根、叶表达差异，过表达提高了植株的抗寒能力［8］。可见，通过分析基因响应不同逆境的转录水平，可以推测其在逆境响应中可能的生物学功能。JrGSTU23能不同程度地响应激素及非生物胁迫，表明其参与了核桃的逆境响应调控。后续研究将通过在植株中过量表达全面分析JrGSTU23基因的抗逆响应功能。

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