鼠李糖乳杆菌对一次性大强度运动小鼠肝损伤的保护作用

郝慧祯，曹建民，曹 卉，艾 坤，徐 鹏

（1.内蒙古师范大学体育学院，内蒙古 呼和浩特 010022；2.北京体育大学，北京 100084）

超负荷的运动会引起一系列的不良身体反应，其中包括肠道应激综合征和急性肝损伤。一次性大强度运动作为一种生理应激还会引起肝细胞血流的改变，从而导致不同程度的肝细胞缺氧，致使肝组织损伤。有大量研究证明，通过益生菌代谢产生的短链脂肪酸可以为肠道细胞提供营养，改善肠粘膜的通透性，从而改善肠道功能，降低细菌异位程度。由于肝肠轴的存在，肠道功能紊乱会致使肝脏功能受到影响。因此，补充益生菌来达到维持肠道功能正常的目的对保护肝脏有积极且重要的影响。本文拟通过一次性大强度游泳运动作为应激刺激，在不同时间点取材，测试实验组（益生菌组）和对照组（蒸馏水组）小鼠在游泳运动后不同时间点的血液中丙氨酸氨基转移酶（Alanine Transaminase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）和肝脏组织中肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，iNOS）的浓度，观察补充鼠李糖乳杆菌是否有加速上述指标恢复的效果。在竞技体育和大众健身中，为补充益生菌缓解运动性疲劳和免疫力下降等情况提供理论参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

鼠李糖乳杆菌对一次性大强度运动小鼠肝损伤的保护作用。

1.2 运动模型

实验对象为SPF级雄性BALB/C 小鼠（鼠龄6～8 周，体重18～22g）48只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产合格证编号SCXK（京）2012—0001。小鼠随机分为8组，每组8只，为蒸馏水安静组（c1）、蒸馏水运动后3h组（c2）、蒸馏水运动后12h组（c3）、蒸馏水运动后24h组（c4）和益生菌安静组（y1）、益生菌运动后3h组（y2）、益生菌运动后12h组（y3）和益生菌运动后24h组（y4）。实验共19d，各组小鼠连续灌胃2周。采用鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus GG，LGG），用蒸馏水稀释浓度为109CFU/ml，每只小鼠按5ml/kg体重灌胃。安静组不进行任何训练，其他组进行2次适应性游泳训练，每隔2d进行1次，最后一次性负重6%进行游泳训练，小鼠力竭判断标准按Thomas 报道之文献。然后按照实验安排处死。采用100cm×50cm×60cm的泳槽作为小鼠游泳训练装置，水深50cm，水温（31±2）℃。第1d：称重，分组，编号，适应性饲养；第2～第4d：适应性饲养；第5～第18d：9：00—各组小鼠按5ml/kg体重灌胃。第12开始进行运动组2次适应性训练，最后进行一次性负重6%游泳训练，具体训练取材安排，见表1。

1.3 实验仪器与试剂

1.3.1 实验仪器 分光光度计。

1.3.2 实验试剂 （1）一氧化氮试剂盒；（2）一氧化氮合酶测定试剂盒；（3）丙氨酸氨基转移酶试剂；（4）天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒；（5）小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析试剂盒。

1.4 标本制备

1.4.1 血清制备 小鼠乙醚麻醉，眼眶静脉取血，离心取上层血清分装，－80℃超低温冰箱冻存。

1.4.2 组织取样 各组小鼠根据实验安排处死，取肝左侧叶，保存于超低温冰箱。取样本0.2g，剪碎后按照1∶9的比例加入9%的生理盐水，用电动匀浆机在冰水浴中进行匀浆。提取上层清液，即制备10%组织匀浆液。

表1 小鼠游泳训练取材方案

表2 安静组与运动组ALT、AST活性结果统计 U/L n=6+s

表2 安静组与运动组ALT、AST活性结果统计 U/L n=6+s

注：a表示与c1相比有高度显著性差异（P＜0.01），b表示与y1相比有高度显著性差异（P＜0.01），c表示与c2相比有高度显著性差异（P＜0.01），d表示与c3相比有高度显著性差异（P＜0.01），e表示与c4相比有高度显著性差异（P＜0.01）。

组别ALT AST 124±5.22 137±2.01a 111±3.02 121±1.70b 137±2.01 121±1.70c 96.4±2.38 82.5±5.55d 81.4±1.72 63.8±2.69e c1 c2 y1 y2 c2 y2 c3 y3 c4 y4 67.9±2.84 76.1±2.93a 52.0±3.05 64.7±2.55b 76.1±2.93 64.7±2.54c 52.9±4.07 42.2±3.68d 38.7±2.66 27.1±3.19e

表3 不同营养干预NO、iNOS、TNF-α结果统计+s

表3 不同营养干预NO、iNOS、TNF-α结果统计+s

注：a表示与y2相比高度显著性差异（P＜0.01），b表示与c2相比有高度显著性差异（P＜0.01），c表示与c4相比有显著性差异（P＜0.05）。

组别NO （umol /gprot n=6）iNOS （U/mgprot n=6）TNF-α（ng/L n=6）c2 y2 c3 y3 c4 y4 5.99±0.256 6.07±0.362 5.20±0.369 5.39±0.299 6.83±0.908 6.29±0.475 3.11±0.175 2.75±0.157a 2.61±0.362 2.76±0.159 3.23±0.363 3.07±0.304 112±3.68 106±2.82b 95.5±4.73 87.5±7.33 100±3.54 91.1±5.53c

1.5 指标检测

1.5.1 ALT测定 采用紫外—乳酸脱氢酶法。

1.5.2 ALT含量测定 采用紫外—苹果酸脱氢酶法。

1.5.3 NO测定 采用硝酸还原酶法。

1.5.4 iNOS测定 肝组织匀浆内iNOS的计算公式为：肝组织中iNOS活性（U/ml）=（总NOS测定管OD值－空白管OD值）/呈色物纳摩尔消光系数⋆反应总体积/取样量⋆1/（比色光镜⋆反应时间）/蛋白含量（mgprol/L）=（总NOS测定管OD值－空白管OD值）/（38.3⋆10-6）⋆（2.41+a⋆）/a⋆x1/（1⋆15）/ 蛋白含量（mgprol/L）。

1.5.5 小鼠TNF-α酶联免疫分析测定应用双抗体夹心法测定标本中小鼠TNF-α水平。

1.6 统计学分析

使用SPSS 19.0对实验结果进行统计分析。使用配对样本t检验进行组内比较，独立样本t检验进行组间比较，显著性水平为P=0.05。所有数据用平均数±标准差（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠力竭情况

8组小鼠中运动组小鼠均完成了一次性大强度运动，整个过程中基本未出现拒绝游泳的现象。运动时间为63±3min。

2.2 血清生化指标的变化

ALT和AST活性的增高是肝胆疾病的表征之一。本文通过运动前后ALT和AST活性来判断运动损伤建模是否成功，如运动后活性大于运动前活性，且有统计学意义，则说明建模成功。根据表c组与y组独立样本t检验统计的结果可以看出，运动后大于运动前，且有统计学意义，小鼠急性肝损伤模型建模成功。将运动蒸馏水组与运动益生菌组以时间点为基准对ALT和AST活性进行比较，益生菌组活性低于蒸馏水组。统计结果用平均值±标准差，如表2所示。将各时间组进行独立样本检验，其P值均小于0.05，具有统计学意义，认为营养干预对小鼠一次性力竭运动所造成的肝损伤可能有一定的保护作用。

2.3 肝组织生化指标的改变及讨论

NO在体内大量产生时会引起大量有毒代谢物的产生，致使肝脏损伤，是引起肝细胞凋亡的重要因素。故经益生菌干预后小鼠组织内NO含量能够在一定程度上反映出益生菌在一次性大强度力竭运动中保护肝脏的作用。表3将运动蒸馏水组与运动益生菌组以时间点为基准进行NO活性进行比较，益生菌组小鼠组织中NO含量与蒸馏水组小鼠组织中NO含量无明显差异。推测是由于取材后将样品放入液氮保存进而转存至超低温冰箱，并未使用新鲜样品直接进行测定，故以上因素可能会对实验结果造成一定影响。NOS可以以左旋精氨为底物催化生成NO，所以iNOS的活性可以有效地反应肝脏内NO的情况。将运动蒸馏水组与运动益生菌组以时间点为基准对iNOS活性进行比较，如表3。y2组小鼠iNOS活性低于c2组，经独立样本检验其显著性低于0.05，具有统计学意义。但运动后12h组与运动后24h组NOS活性并没有显著性差异，推测是由于取材后将样品放入液氮保存进而转存至超低温冰箱，并未使用新鲜样本直接进行测定，以上因素可能会对实验结果造成一定影响。TNF-a是内毒素所致的急性肝损伤中的炎症反应的启动因子。能激活级联反应，引起肝脏损伤，如表3。将运动蒸馏水组与运动益生菌组以时间点为基准进行TNF-α含量进行比较，y2和y4组小鼠TNF-α含量均低于c2和c4组。经独立样本检验P＜0.05，具有统计学意义。这证明益生菌能够通过肝-肠轴作用到肝细胞内，可能会对一次性大强度运动造成的肝损伤进行保护。

3 讨 论

3.1 一次性力竭运动对小鼠肝脏的影响

在超负荷运动中，机体处于缺氧状态；体内血液分布发生改变，血液由内脏器官大量流向肌肉组织，以上两种因素共同作用，导致肝损伤的发生。

本次研究发现，一次性力竭运动可以导致小鼠肝脏损伤，其表现为血清中ALT、AST活性增高。通常，ALT在肝脏组织中活性最强，AST在心肌细胞和肝细胞中有较强的酶活性。当肝细胞受损，出现炎症反应，肝细胞细胞膜完整性受到破坏甚至溶解，线粒体内容物扩散至组织和血清中，引起血清中转氨酶幅度大幅上升。

3.2 益生菌对一次性力竭运动引起的小鼠肝损伤的保护作用

本研究中针对小鼠进行了益生菌营养干预。结果显示，补充益生菌的小鼠相较于蒸馏水组，血清中ALT和AST活性大幅下降，这证明肝细胞膜受到了一定的保护，在没有补充益生菌的小鼠中，其细胞膜通透性大幅增加，致使小鼠血清中ALT、AST的活性有显著性增高。而在补充益生菌的小鼠血清中，尽管其ALT、AST的活性也增高了，但是其增高显著低于蒸馏水组，这说明益生菌的补充有益于保持肝细胞膜的完整性。

肠道黏膜屏障的完整性主要依靠肠上皮细胞维持，通过微绒毛等保证屏障结构功能完整。TNF-α与肝损伤和肠粘膜损伤密切相关。当肠粘膜通透性增高时，肠道细菌代谢产生的毒素、细菌及一些大分子物质可以穿过肠道屏障进入血液或者腹腔，引起肝脏内环境的改变。TNF-α是一种具有多态性的细胞因子，与炎症发生、细胞凋亡、新陈代谢等相关。而这些生物活性和其重要的调节功能，与急性肝损伤的发生发展密切相关。在急性肝损伤过程中，TNF-α含量较低时，可以抑制细胞的凋亡，而浓度过高时，加重损伤的恶化。在组织处于氧化应激的状态下，iNOS即诱生型NOS被激活，持续大量的NO被合成、释放，具有显著的肝细胞毒作用。在研究中，运动益生菌组小鼠组织中NO的结果与运动蒸馏水组没有明显差异，这可能是由于未使用新鲜样本进行测试造成的。组织中iNOS在运动后3h，益生菌组要显著低于蒸馏水组。由于NO不稳定极易降解，样本保存措施不当，以至出现上述结果。

4 结 论

一次性大强度运动后，小鼠血液中ALT，AST活性增高，证明小鼠发生急性肝损伤，小鼠血液中TNF-α含量增高，而益生菌营养干预可以使小鼠血液中TNF-α含量降低。推测益生菌通过改善肠粘膜通透性抑制细菌异位，减少了肝组织细胞内环境的改变，从而达到保护肝脏的目的。