白花丹素通过PI3K/AKT/mTOR通路增强PF方案杀伤舌鳞癌细胞

周凡 潘淑婷 邱嘉旋

舌鳞状细胞癌是口腔癌中最常见的恶性肿瘤，其恶性程度较高且容易复发[1]。新辅助化疗PF方案，即手术或放疗前采用顺铂+5-氟尿嘧啶化疗，是舌鳞癌综合治疗的重要部分，能提高患者生活质量和远期生存率[2]。但仍有部分肿瘤对化疗药物不敏感并出现耐药现象严重影响其疗效[3]。细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种依赖溶酶体降解途径，它是不同于凋亡的一种II型程序性死亡方式，可通过吞噬、降解细胞内损伤、衰老的蛋白或器官维持基因完整性和细胞稳态。自噬活性改变与肿瘤的发生发展相关[4]。少量的细胞自噬可介导肿瘤细胞存活，过量的细胞自噬可介导肿瘤细胞自噬性死亡[5]。

白花丹素是从白花丹根茎中分离的一种醌类成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物活性[6]。对多种肿瘤细胞均有杀伤作用，对正常细胞无明显毒性[7]。本课题组前期研究发现白花丹素能够增强术前PF化疗方案对舌鳞癌细胞的杀伤作用[8]，其作用机制尚未报道，本研究探讨白花丹素对PF化疗方案杀伤舌鳞癌CAL27细胞凋亡和自噬的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖培养基(12100-500)、MTT(M8180)、DMSO(D8370)、蛋白提取试剂盒(PC0020)(北京索莱宝公司)；胎牛血清(TBD 11-HT，TBD生物公司)；白花丹素(481-42-5，Sigma公司，美国)；顺铂(国药准字H37021358，山东齐鲁制药厂)；5-氟尿嘧啶(国药准字H32022246，南通精华制药有限公司)；IGF-1(100-11-100)、β-actin一抗(14439-1-AP)(Proteintech公司，美国)；MHY1484(HY-B0795，MCE®，美国)；凋亡试剂盒(KGA106，南京凯基生物有限公司)；Cyto-ID®自噬检测试剂盒(ENZ-51031-0050，ENZO公司，美国)；Beclin1(3495S)、LC3B(3868S)、PI3K(4249)、AKT(4691S)、p-AKT(Ser473)(4060)、mTOR(2983T)、p-mTOR (Ser2448)一抗(5536)(CST公司，美国)；山羊抗兔二抗(ZB-2301、中杉金桥)。

1.2 方法

1.2.1 细胞系及细胞培养 舌癌细胞系CAL27(由上海交通大学附属第九人民医院基础实验室冻存提供)；CAL27细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)中贴壁生长，于37 ℃、100%湿度、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长达80%左右，用含有0.05% EDTA及0.25%的胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 取对数期CAL27细胞以5 000 个/孔接种于96 孔板中，每孔180 μL，待细胞贴壁生长后，设对照组、PB组(3.5 μmol/L)、PF组(顺铂2.5 μg/ml、5-氟尿嘧啶320 μg/ml)、PB+PF组(PB3.5 μmol/L、顺铂2.5 μg/ml、5-氟尿嘧啶320 μg/ml)。每组设5 个平行复孔，继续培养24 h后，每孔加入20 μl新鲜配置的0.5%MTT试剂，避光作用4 h后，小心弃上清，加入100 μl DMSO/孔，避光摇匀15 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在490 nm波长下测定各孔的吸光度A值。根据公式：存活率(%)=[(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%；抑制率(IR)：IR=1-存活率；计算每组细胞存活率及抑制率。PB联合PF用药的细胞抑制率按照金氏公式[9]判断：Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，[其中E(a+b)为 PB +PF时的抑制率，Ea、Eb分别为 PB和PF单独作用时的抑制率]。0.85≤Q<1.15为两药相加作用，Q≥1.15为两药协同作用，Q<0.85为两药拮抗作用。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 取对数期CAL27细胞按3×105个/孔接种于6孔板中，次日，按不同分组加药处理24 h后，收集悬浮细胞及贴壁细胞，根据流式凋亡检测试剂盒说明书进行操作，AnnexinV-FITC/PI双染色，室温下避光染色15 min，上流式细胞仪检测。Flowjo 7.6软件分析Annexin V/PI阳性细胞所占百分率即细胞凋亡率。

1.2.4 Cyto-ID荧光显微镜观察细胞自噬 取对数期CAL27细胞按一定细胞数量接种于含载玻片的24 孔板中，37 ℃培养，待细胞贴壁60%后进行药物干预继续作用24 h。加入Cyto ID和Hoechst 33342染色，荧光显微镜下(放大倍数为40)观察自噬并拍照。采用Image J软件对图像进行分析，随机选取4 个面积等大的视野，计算荧光吸光度平均值。

1.2.5 Western blot检测自噬相关蛋白及信号通路相关蛋白的表达 对数期CAL27细胞经不同条件处理后，提取各组细胞蛋白，测定蛋白浓度，于-80 ℃储存备用。配置6%～12%的聚丙烯酰胺凝胶，电泳、转膜后，5%脱脂奶粉或5%BSA室温封闭2 h，一抗[Beclin1、LC3B(均1∶1 000)；PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR、p-mTOR(均1∶500)]4 ℃孵育过夜，TBST洗膜8 min×3，二抗[山羊抗兔(1∶6 000～2 000)]室温孵育1 h，TBST洗膜8 min×3，加入显影液，采用Bio-Rad ChemiDocTM XRS电子显像系统显影采集图像。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 PB联合PF方案对CAL27细胞的增殖抑制作用

MTT检测结果发现，PB联合PF组较单独应用PF方案，其对CAL27细胞24 h抑制率明显增加，差异具有统计学意义(P<0.001)，且联合用药24 h时计算Q值为1.167>1.15，提示PB增强了PF方案对舌鳞癌细胞的增殖抑制作用(表 1)。

2.2 PB增强PF方案对CAL27细胞的凋亡作用

流式细胞仪结果发现，不同药物组作用于CAL27细胞24 h后，PB联合PF较单独应用PF方案，其细胞凋亡率明显升高(P<0.001)(图 1)。

图 1 不同药物组对CAL27细胞凋亡率的影响

Tab 1 Inhibition of the proliferation of CAL27 cells by various treatments

组别细胞抑制率(%)(24 h)对照组0PB组17.25±3.862PF组26.00±2.582PB+PF组45.25±4.349

2.3 PB增强PF方案对CAL27细胞的自噬作用

2.3.1 Western Blot检测CAL27细胞中Beclin1、LC3的表达 在CAL27细胞中，PB组较空白组、PB+PF组较PF组比较，细胞中Beclin1的表达水平上调，且LC3II/LC3I的比值也升高(P<0.001)，提示PB能够增强PF方案化疗CAL27细胞的自噬作用(图 2)。

2.3.2 Cyto ID荧光显微镜检测自噬水平 Cyto ID荧光显微镜下观察发现，PB单独作用时，CAL27细胞内自噬率较空白组增加，而PB+PF组较单独PF组比较，细胞内自噬率亦明显增多(P<0.001)。结果同样表明PB能够增强PF方案化疗CAL27细胞的自噬作用(图 3)。

图 2 不同药物组对CAL27细胞中Beclin1、LC3蛋白的影响

图 3 不同药物组对 CAL27细胞的自噬水平的影响

2.4 PB通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导PF化疗舌鳞癌CAL27细胞的凋亡和自噬

2.4.1 白花丹素下调PF化疗CAL27细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达 Western blot检测结果示，PB组较空白组比较，CAL27细胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达均不同程度降低(P<0.05)，实验组PB+PF较单独PF组比较，细胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达显著降低(P<0.05)。提示白花丹素能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路(图 4)。

2.4.2 PI3K/AKT/mTOR激动剂能够抑制白花丹素诱导PF化疗CAL27细胞的凋亡和自噬 我们采用PI3K/AKT激动剂IGF-1(10 ng/ml)、mTOR激动剂MHY1485(10 μmol/L)分别预处理细胞后，实验分为空白组、IGF-1组、MHY1485组、PB+PF组、IGF-1+PB+PF组、MHY1485+PB+PF组，经流式细胞仪检测细胞凋亡(图 5)、Cyto ID荧光显微镜检测自噬水平(图 6)，Western Blot检测自噬相关蛋白及信号通路磷酸化水平蛋白(图 7)，结果显示，PB+PF组分别联合IGF-1 、MHY1485作用时，较PB+PF作用组，CAL27细胞凋亡与自噬均有不同程度减少(P<0.001)。同时加入激动剂组不同程度逆转了PB对PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达的抑制作用(P<0.05)(图 7)。

图 4 不同药物组对CAL27细胞中信号通路蛋白表达的影响

图 5 PI3K/AKT/mTOR激动剂作用后对PB诱导PF化疗CAL27细胞凋亡的影响

3 讨 论

舌鳞癌是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤，有效的术前化疗能够很大程度提高其远期生存率[10-11]，PF化疗方案是舌鳞癌综合治疗的重要部分，白花丹素能增强其疗效[8]。细胞凋亡作为肿瘤细胞死亡的一种机制，近年来自噬被认为是预防和治疗肿瘤的重要靶点[12]，自噬是一种高度保守的细胞行为，参与细胞器降解与再利用过程，与细胞的生长、增殖及肿瘤的发生过程密切相关。Beclin1、LC3是检测自噬标志性蛋白。在肿瘤化疗过程中，当自噬达到一定程度时可发生自噬性死亡，对杀死肿瘤细胞具有重要作用[13]。

白花丹素是中草药白花丹的主要活性成分，有研究者表明，白花丹素在肿瘤细胞和动物模型中具有促凋亡[14]及促自噬性死亡[15]的作用。我们前期研究发现白花丹素能够增强术前PF方案对舌鳞癌细胞的杀伤作用[8]，且与PI3K/AKT/mTOR通路蛋白有关[16]。在本实验PF方案化疗CAL27细胞中我们发现，实验组PB联合PF方案较单独应用PF方案，其凋亡率明显增加，且细胞中Beclin1、LC3蛋白表达均不同程度上调，提示白花丹素增强PF方案杀伤CAL27细胞的过程中不仅细胞凋亡增加，且自噬作用亦增强从而发生自噬性细胞死亡。

图 6 PI3K/AKT/mTOR激动剂作用后对PB诱导PF化疗CAL27细胞自噬的影响 (×40)

Fig 6 The effects of PI3K/AKT/mTOR activitors on the autophagy of CAL27 cells induced by PB in PF chemotherapy (×40)

图 7 PI3K/AKT/mTOR激动剂作用后自噬及信号通路相关蛋白表达情况

Fig 7 The effects of PI3K/AKT/mTOR activitors on autophagy and signaling pathway related proteins expression

PI3K/AKT/mTOR是细胞内非常重要的信号转导途径，与人类多种恶性肿瘤的发生有着重要的关系[17-18]，参与调控细胞的凋亡、存活、增殖、生长、分化、代谢迁移和血管生成[19]。研究表明白花丹素可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导乳腺癌细胞[15]、非小细胞肺癌细胞[20]凋亡和自噬。通过Western blot检测结果发现，PB联合PF方案较单独PF方案作用，其CAL27细胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达量显著降低，提示PB能够抑制CAL27细胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达从而抑制PI3K/AKT/mTOR通路。为求进一步验证，PB是否是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路从而诱导PF方案化疗舌鳞癌CAL27细胞凋亡和自噬，分别采用PI3K/AKT激动剂IGF-1(10 ng/ml)、mTOR激动剂MHY1485(10 μmol/L)来激活该通路，结果显示，PB+PF组加入IGF-I、MHY1485后其CAL27细胞的凋亡率一定程度下降，Beclin1、LC3蛋白表达下调。而原本在PB+PF组中，白花丹素对PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的下调作用减弱，提示IGF-1、MHY1485逆转了PB对PF化疗CAL27细胞中PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用。

因此，本研究发现白花丹素能够增强术前PF方案对CAL27细胞的杀伤作用，上述过程同时诱导PF方案对CAL27细胞的凋亡和自噬作用，且白花丹素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来发挥作用。