高正加速度对口腔种植体骨结合影响的动物实验研究

朱晓茹 邓天政 逄键梁 刘冰 柯杰

本课题组通过对空军飞行人员口腔疾病大规模流行病学调查，发现牙列缺损在军事飞行人员及招飞学员中的发生率大于10%，牙列缺损引起的咀嚼、咬合及颞颌关节疾病对飞行安全有着严重影响[1]。由于军事飞行人员及航天员在飞行过程中会遇到超重、失重等各种特殊的力学环境，传统的修复治疗手段有一定的局限性。目前种植牙修复牙列缺损已被越来越多的用于临床。俄罗斯宇航局就曾在2006 年报道了一例宇航员种植术后在太空生活6个月后的情况，结果认为种植牙对于宇航员未造成不良影响[2]，但由于国内外这方面的研究数据较少，因此该技术还未能在我军飞行人员中应用。本研究即针对这一情况，从动物水平观察高正加速度(+Gz)状态对种植体与骨组织结合的影响，以期为种植术在军事飞行员及航天员中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 新西兰白兔18 只，雄性，体重(2 485±248) g，口内状况良好，购自北京联合利华实验动物养殖中心。

1.1.2 主要实验设备 纯钛种植体(山东烟台威高医疗器械公司)： 种植体形态(图 1)，种植体表面经过大颗粒酸蚀喷砂处理，γ射线消毒后单独包装备用；手术器械：牙科探针、拔牙钳、微创挺、止血钳、持针器、可吸收缝线、眼科剪、种植体持钉器。术前手术器械常规高温高压消毒灭菌；其他实验设备：小动物离心机(长春奥普光电技术股份有限公司)；Inveon Micro-CT机、CT扫描软件Inveon Acquisition、CT分析软件Inveon Research、CT重建软件COBRA_Exxim(Siemens，德国)；光学显微镜(Olympus，日本)；切片机(Leica 1600， Leica，德国)。

图 1 种植体设计图及实物图

1.2 实验方法

1.2.1 实验方案 按随机数字表将18 只实验动物随机分为A1(3 周对照组)、B1(3 周实验组)、A2(5 周对照组)、B2(5 周实验组)、A3(12 周对照组)、B3(12 周实验组)6 组，每组3 只。

实验动物在适应性饲养1 周后，在3%戊巴比妥钠腹腔麻醉和1%阿替卡因肾上腺素注射液局部麻醉下，拔除兔子下颌2 颗切牙，在每个拔牙窝内即刻种植1 颗种植体，植入扭力矩为15 N·cm，术后严密缝合下颌牙龈。术后给动物肌注青霉素40 万U/d，并每天清理口腔，连续3 d，期间密切观察其伤口愈合情况及精神活动状况。

术后休息1 周，然后实验组动物(B1、B2、B3组)在小动物离心机上开始加载+Gz。我们根据飞行员飞行训练以及实战演练的实际情况，并参考国军标GJB4423-2002及国外的训练方案[3]，设定了图2所示的实验动物每次的加载方案，加速度的增长率为1 G/s，加载间隔为1 min，每周加载3 次。对照组动物不加载+Gz，常规饲养。

图 2 实验组动物离心训练方案

A1、B1组在加载+Gz 2 周后处死，A2、B2组在加载+Gz 4 周后处死，A3、B3组在A3组加载+Gz 4 周，然后常规饲养7 周后处死。截取含种植体的标本，修整以后以生理盐水反复冲洗，放入4%的甲醛溶液中固定。每组最后收获6 个标本。

1.2.2 观察指标 ①动物一般情况观察;②Micro-CT扫描及骨组织形态计量学分析。将标本采用Micro-CT机进行扫描，扫描分辨率为8.99 μm。扫描结果进行三维重建分析。将种植体中下2/3段周围1mm的区域设为兴趣区(region of interest，ROI)，进行骨组织形态计量学分析，分析的主要参数包括：骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁间隙(trabecular spacing, Tb.Sp)[4];③组织学观察及种植体-骨结合率(bone implant contact, BIC)分析。将Micro-CT扫描过的种植体标本修整后制作不脱钙种植体-骨磨片。将标本依次脱水、透明后树脂包埋，然后用切片机将标本颊舌向纵向切割成150 μm厚的切片，再研磨至30 μm厚。然后进行亚甲基蓝-酸性品红染色并封片，在光学显微镜下观察每个种植体切片的中下2/3部分，并拍摄照片，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行测量分析，计算BIC。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，若满足方差齐性，则采用2 组独立样本的t检验进行分析，若不齐，则采用秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 大体观察

18 只实验动物均顺利完成了拔牙和即刻种植手术，术后均无死亡，术后第2天动物可自主少量进食。术后术区伤口愈合良好，无红肿流脓等症状。实验组动物能够耐受实验中设计的+Gz环境，在加载+Gz后无明显异常。

2.2 Micro-CT扫描结果和骨组织形态计量学分析

Micro-CT扫描重建结果显示，种植体周围骨小梁排列整齐、呈密集网状结构，骨小梁组织包绕各组种植体表面，与种植体紧密接触，形成种植体-骨结合界面。随着观察时间增加，种植体周围(ROI)骨小梁的数量和厚度都有明显增加(图 3)。

图 3 三维重建后各组种植体ROI的骨小梁情况

随着术后观察时间的增加，2 组动物的BV/TV、Tb.Th、Tb.N均有所增加，而Tb.Sp逐渐降低。对照组动物在3～5 周时间段各指标变化比较明显，而实验组在5～12 周的各指标变化比较明显。

术后3 周和12 周时， ROI区域骨体积定量(VOI)实验组骨各指标与对照组相比均没有明显的统计学差异；术后5 周时，实验组BV/TV和Tb.N明显低于对照组，而Tb.Sp明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)(表 1)。

2.3 组织学观察及BIC分析

表 1 各组种植体VOI区域的骨组织计量学分析

注： ① 与对照组相比，P<0.05

种植体-骨磨片在进行亚甲蓝-酸性品红染色后，光学显微镜下可见：红色为骨小梁，蓝色为成骨细胞、成纤维细胞、类骨质等间质。术后3 周，对照组种植体周围的部分表面被粗细不均的骨小梁包绕，部分表面与骨髓腔直接接触；种植体螺纹表面有新骨形成，并向种植体表面和外周基骨方向延展。实验组种植体周围个别区域仍有大量的炎性细胞，类骨质和纤维组织较多。术后5 周，对照组新生骨继续沿种植体螺纹表面生长，并开始形成较为成熟的骨小梁形态；同时还可以观察到距离成骨，种植体周围的基骨组织向种植体表面生长；种植体周围骨小梁增粗、面积增大，且种植体-骨界面骨改建活跃。实验组与对照组相比种植体周围的骨小梁较稀疏。术后12 周，2 组种植体周围骨小梁结构均较粗大、致密且连续性好，以板层骨为主，可见到哈弗系统(图 4)。

BIC随术后观察时间的增加而逐渐增高，在各时间点实验组BIC都略低于对照组，且5 周和12 周时2 组BIC的差异有统计学意义(P<0.05)(表 2)。

图 4 各组种植体-骨磨片组织学观察 (HE， ×20)

Fig 4 Histological examination of the implant-bone ground sections (HE， ×20)

表 2 各组种植体的种植体-骨结合率 (BIC, %)

Tab 2 Bone-implant contact of the 2 groups (BIC, %)

注： ① 与对照组相比，P<0.05

3 讨 论

战斗机飞行员在飞行过程中会遇到各种特殊的力学环境。当战斗机在做盘旋、筋斗、半筋斗翻转、半滚倒转等曲线飞行时，飞行员会受到由足指向头的持续性+Gz(也叫正超重)作用；航天员在发射和回收过程中也会受到持续性+Gz的作用[5-6]。研究发现持续性+Gz作用于人体时，引起的主要生物力学效应包括体重增加、血液柱流体静压增大、血液向下半身转移、头颈部血流量减少、器官移位及变形等[7-8]。但是目前关于高+Gz环境对种植体与骨结合影响的研究还未见报道，因此本研究旨在从动物模型的水平研究高+Gz对种植术后骨结合的影响。

由于本研究要在动物离心机上为动物加载+Gz，而我们的小动物离心机目前能离心的最大动物是兔子；而且加载+Gz时，颌骨与下肢长骨所受的力是不同的，因此在颌骨上植入种植体最接近实际情况；若待兔拔牙后牙槽骨改建后再进行种植手术，常常会出现牙槽骨高度不足、骨壁变薄等问题。因此在综合考虑以上因素的情况下，本实验采用拔除兔双侧下颌切牙后即刻植入种植体的模型进行研究。

本研究采用Micro-CT检测以及硬组织切片观察的方法观察了高+Gz环境对兔下颌前牙区种植后骨结合的影响。结果显示种植术后加载高+Gz 2 周对骨结合没有明显影响，加载高+Gz 4 周时，实验组骨结合明显较对照组差，但是不加载+Gz后，经过7 周的恢复，在术后12 周时，实验组和对照组除BIC外各观测指标无明显差异。

实验组与对照组种植体都有与时间呈正相关的成骨效应，BV/TV、Tb.Th、Tb.N以及BIC都有逐渐增高的趋势，而Tb.Sp有逐渐减小的趋势。对照组各观测指标在3 周到5 周时变化比较明显，而在5 周到12 周时变化比较平稳，说明新骨形成主要发生在种植术后前5 周时间段内，而5 周到12 周新骨形成减缓，主要以骨改建为主，骨小梁逐渐融合，编织骨逐渐转化为板层骨，骨组织矿化程度增高，新生骨组织逐渐趋于成熟。这一结果与以往的研究都比较一致[9-11]。与对照组相比，实验组BV/TV、Tb.N以及BIC在5 周时都明显低于对照组，而Tb.Sp明显高于对照组，而在12 周时除BIC外实验组各观测指标与对照组相比没有明显差异，这说明高+Gz环境使种植术后的新骨形成速度减缓，对骨结合有不利影响，而停止加载高+Gz，经过一段时间的生长改建，种植体的骨结合还能够有所恢复。

研究发现，当成骨样细胞处于低水平高重力(2～5 g)环境中时，细胞增殖显著增加[12]，而处于高水平高重力(40～80 g)环境中时，细胞增殖反而受到抑制[13-14]。动物实验也发现2 g高重力环境对大鼠股骨的形成和皮质骨成分影响不显著，但胶原交联和骨成熟度增加[15-16]；而3 g高重力环境就会对小鼠的骨骼系统产生有害影响，使骨皮质变薄、破骨细胞增加。这些结果说明超重状态对于骨细胞以及骨结合的影响可能存在一个“临界点”，在“临界点”以上时高重力状态就会抑制成骨细胞的增殖及分化，影响到种植术后的骨结合。但是其影响的具体机制目前还不清楚，这也是我们的课题下一步要研究的方向。

总之，我们的研究结果表明，种植术后早期就进入高+Gz环境对种植体-骨结合有不利影响，因此建议飞行人员如果进行种植修复的话，在种植术后应适当延长休息停飞时间，在骨结合完成后再进行飞行训练。