结合GC-MS的分子蒸馏富集柚皮精油抗氧化成分的研究

王 芳 岳朝敏 Andreea David 林洁茹 何宇城 邓 刚

(浙江师范大学化学与生命科学学院1，金华 321004)(浙江师范大学行知学院2，金华 321004)

分子蒸馏(Molecular Distillation, MD)，又叫短程蒸馏，是一种特殊的液-液分离技术，它是依据不同物质分子运动平均自由程的差异来实现分离。分子蒸馏是一种工作在高真空(0.1～100 Pa)，低沸腾温度(20～65℃)条件下的分离技术[1]，非常适合热敏性、高沸点物质的分离[2-3]，因此近年来该技术被广泛应用于油脂脱酸、不饱和脂肪酸的精制、油溶性脂肪酸的提纯等领域[4-7]。植物精油的主要成分是醛、酮、醇类，大部分为萜类化合物，具有高沸点、热不稳定及易氧化等特点[8]，传统分离方法如精馏法、浸提法等易引起分子重排、氧化等，导致精油成分破坏[9-10]，而真空低温条件下的分子蒸馏技术不仅可能保证精油的品质，而且能够高效提纯或富集精油中的一些香气成分或活性成分，是一种理想而有前景的精油精制方法。

近年来有关分子蒸馏用于精制植物精油的研究日新月异，主要研究集中工艺优化[11]、精油脱萜脱毒[12]、精油赋香性[13]等方向，尚需加强分子蒸馏在组分多杂植物精油的应用基础研究，考察分子蒸馏如何实现对植物精油分级精炼，进而达到甄别香气、浓缩活性以及脱除杂质的目标。本研究实验材料为琯溪蜜柚[Citrusgrandis(L.) Osbeck]的果皮精油，由于柚子属大宗水果，种植面积大，年产鲜果上千万吨。目前国内精油市场规模在200亿元～220亿元[14]，精油的使用广泛[15]，但精深加工方法不多，精油附加值低。本实验对水蒸气蒸馏得到的柚皮精油，尝试采用了二阶段分子蒸馏，通过调控关键蒸馏条件，最终得到差异明显的多种馏分，结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)的组分分析和各馏分的抗氧化活性的测定，找寻并富集柚皮精油抗氧化成分。

1 材料与方法

1.1 材料

柚皮精油：采用水蒸气蒸馏法从琯溪蜜柚皮中制得，淡黄色，用无水硫酸钠干燥，过滤后将粗精油存于棕色瓶中，-20 ℃保藏。

1.2 仪器与试剂

KDL 5分子蒸馏仪：德国UIC公司；7890A-5975C气相色谱-质谱仪：美国Agilent公司；UV-2550紫外可见光分光光度计：日本Shimadzu公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)、过硫酸钾(K2S2O8)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷、环己酮为色谱纯：德国Merck公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 柚皮精油分子蒸馏实验设计

柚皮精油分子蒸馏实验条件的调控及选取是综合考虑了对各馏分组成分析和收率的实时测定结果，其中可变调控参数包括蒸发器温度为20～60 ℃，一级冷凝器为-10～15 ℃，系统真空度1～10 Pa，其他参数包括二级冷凝器温度(-20 ℃)、冷肼温度(液氮冷却)、刮膜转速(100 r/min)，进料流速(1 mL/min)在整个蒸馏操作过程中均保持不变。对200 mL柚皮精油进行了第一阶段分子蒸馏后，根据GC-MS对残留液(1RH，重馏分)、一级冷凝器冷凝液(1DM，中间馏分)，二级冷凝器冷凝液(1DL，轻馏分)分析结果，再对组分沸点分布宽的1RH进行了第二阶段分子蒸馏，调节蒸馏温度为25 ℃，一级冷凝器为-10 ℃，真空度190～200 Pa，其他条件不变，得到两个馏分，分别记为2RH，2DM。

1.3.2 柚皮精油成分的GC-MS分析

采用GC-MS法分析了分子蒸馏各馏分及原油的化学组成。气相色谱条件：毛细管柱为Agilent HP-5,30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气为高纯氦气(纯度>99.99%)，流速1 mL/min；进样温度250 ℃，进样量1 μL，分流比1∶50。采用程序升温：初温40 ℃(保持3 min)，然后以5 ℃/min升温至200 ℃(保持5 min)；再以2 ℃/min升温至250 ℃。质谱条件：EI离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；四级杆温度150 ℃；溶剂延迟2 min；接口温度280 ℃；扫描范围40～400 amu，扫描速率3.99 scans/s[16]。

精油组分检测：通过测定相应系列的正烷烃的保留指数(RI)来确定各组分的RI值，并结合比对NIST质谱数据库(G1036A, revision D.01.00)和已报道的相关文献[17]，得到柚皮精油各馏分的化学组成；以环己酮作为内标物，通过气相色谱对各馏分中的各成分进行了定量分析。

1.3.3 柚皮精油抗氧化实验

1.3.3.1 清除DPPH·活力测定

移取0.2 mL 20 mg/mL甲醇精油溶液分别与3 mL 0.004%的DPPH·甲醇溶液混合均匀，置于暗处，室温下反应30 min，在517 nm下测定吸光值Ax,DDPH[18-19]。DPPH·的清除率计算：

式中：A0,DDPH为甲醇对照组。

1.3.3.2 清除ABTS+·活力测定

取7 mmol/L ABTS储备液和2.45 mmol/L过硫酸钾储备液等体积混合均匀，在黑暗室温下静置12～16 h，得到ABTS+·母液。用甲醇稀释母液，2.5 min后，734 nm处测得吸光度值约为0.7±0.05，稀释后的溶液为ABTS+·工作液。取3.6 mL工作液加0.4 mL 20 mg/mL甲醇精油溶液，振摇10 s，以充分混合，黑暗处静置2.5 min，在734 nm处测得吸光值Ax,ABTS[20]。ABTS+·清除率计算：

式中:A0,ABTS为甲醇对照组。

1.3.3.3 相对抗氧化活性等级的计算

为了更直观地了解分子蒸馏后各馏分抗氧化活性的增益或减损，定义了相对抗氧化活性等级(Ralative Level of Antioxidant, RLA)，以馏分油比原油每增加或减少20%为一个等级，记为一个“+”，以此类推，计算公式：

2 结果与分析

2.1 不同馏分化学组成及组分流向

柚皮精油沸点范围分布在150～300 ℃之间，与普通的油脂、脂肪酸物料相比，组分多，分子量小，沸点分布窄，因此采用分子蒸馏技术来精炼精油，难度大，需要精准调控操作参数，其中蒸发温度、冷凝温度及系统真空度变化均会引起较大的组分流向的响应。分子蒸馏条件对馏分得率的影响见表1，若真空度和蒸发温度设置过高(实验序号1)，精油中多数组分的平均自由程远大于蒸馏距离，所有组分均被两级冷凝器俘集，因而完全无重馏分；随着蒸发强度减弱(实验序号2～4)，即降低系统真空度(绝对压力升高)或降低蒸发温度，则精油中越来越多组分将无法汽化而直接降液成为重馏分。当真空度为1～10 Pa、蒸发温度为20 ℃时(实验序号5～7)，该蒸发强度下重馏分占比约为44%～46%，进而设置一级冷凝温度为-10 ℃、二级冷凝温度为-20 ℃，则大部分平均自由程大于蒸馏距离的组分部分被一级冷凝器俘集，而少部分平均自由程远大于蒸馏距离(低沸点组分)的组分在一级冷凝面无法及时冷凝，发生“弹射”而流向二级冷凝器并被俘集。柚皮精油一次蒸馏后各馏分的化学组成分析如图1所示，结合GC-MS分析，这些“弹射俘集”的轻馏分得率低于20%，但组分沸点分布窄(图1d)，基本不含中间馏分中的组分，分离效果好，第二阶段分子蒸馏实验也是依据此现象进行设计。

柚皮精油的化学组成及含量见表2，在柚皮精油中共鉴定出33种化学成分，主要成分是香叶醇(156.52 g/L)、D-柠檬烯(66.33 g/L)和β-石竹烯(41.05 g/L)，与文献报道相符，但含量略有差异[13, 21-22]，可能与果实的生长环境、生长阶段等因素有关[23-24]。在蒸馏温度为20 ℃，真空度为1～10 Pa的操作条件下进行了一级分子蒸馏，馏分1RH共富集了17个沸点较高的组分，并且这些组分的含量较原油显著提高，其中香叶醇浓度由原油的152.65 g/L升高到253.90 g/L，浓缩了1.7倍，β-石竹烯由原油的41.05 g/L升高至77.06 g/L，浓缩了1.9倍；馏分1DL也显著浓缩了原油中低沸点部分的组分，其中D-柠檬烯被最大程度地富集，浓缩比高达4.9。需要指出的是，实验表明分子蒸馏可将柠檬烯从原油中脱除，并与其他主要成分分离，使得精油有效成分的富集成为可能。

表1 分子蒸馏条件对馏分得率的影响

注：Y表示各馏分的得率。

表2 柚皮精油的化学组成及含量

注：-表示未检出，化合物沸点从上到下由高到低。

图1a显示了柚子原油中绝对含量大于0.5 g/L的26种化学组分，这些组分沸点分布在430～550 ℃范围内，经过第一次分子蒸馏，馏分1RH富集了未汽化高沸点组分，基本脱除了低沸点的组分，如图1b所示；馏分1DL富集效应最佳，图1b显示了GC-MS的总离子流图中各组分峰分布窄，并且通过计算组分的摩尔分率可知，1DL中主要含有9种低沸点组分，沸点范围约在430～550 ℃之间，结合馏分1DM组分分析(图1c)，1DM中组分分布较广，即含有重馏分组分，也含轻馏分组分，表明了馏分1DL是那些平均自由程远大于蒸发距离、在一级冷凝器上未被冷凝而被二级冷凝器俘集的组分。

注：bp表示各组分在常压下沸点；RT，RA分别表示GC-MS总离子图中的保留时间和相对丰度。
图1 柚皮精油一次蒸馏后各馏分的化学组成分析

根据抗氧化实验结果，馏分1RH的抗氧化活性显著增强，因此对1RH进行了第二次分子蒸馏以期进一步富集抗氧化成分。在蒸馏温度为25 ℃，真空度为190～200 Pa的条件下进行低强度的分子蒸馏，由于1RH中低沸点组分极少，因此馏出物中仅有两个馏分2RH和2DM，其中2RH中再次富集了香叶醇和β-石竹烯，浓缩比分别为3.7和4.3，同时又进一脱除了部分的D-柠檬烯。

2.2 不同馏分抗氧化活性分析

测定分子蒸馏所得不同馏分对DPPH.和ABTS+.的清除能力，结果表明抗氧化活性强弱顺序为2RH>1RH>2DM>Co(原油)>1DM>1DL，不同馏分对DPPH和ABTS自由基的清除能力如图2所示。Choi等[25]认为柑橘属精油对DPPH·的清除能力与香叶醇的含量呈正相关，而Wang等[26]研究了番石榴(PsidiumguajavaL.)精油的抗氧化活性，其主要抗氧化成分是β-石竹烯。由图2可知，馏分1RH较原油(Co)富集了高沸点组分，尤其是两个抗氧化成分香叶醇和β-石竹烯，同时脱除了低沸点组分，如D-柠檬烯，因而相应的DPPH·和ABTS+·的清除能力显著增强，分别较原油提高60%和46%，而馏分1DM和1DL也因抗氧化成分被脱除而活性下降。值得指出的是，精油的生物活性可能是几种化合物的协同作用[27]，所以柚皮精油对DPPH·和ABTS+·的清除作用，也可能是以香叶醇和β-石竹烯为主的多种高沸点组分共同作用的结果。

注：标注字母为显著性分析 (P<0.05)。
图2 不同馏分对DPPH和ABTS+自由基的清除能力

对抗氧化活性较强的馏分1RH进行了第二次分子蒸馏，对抗氧化成分进行了进一步富集，通过计算各馏分相对抗氧化活性等级，各馏分抗氧化活性富集程度评价见表3，不难发现馏分2RH的抗氧化活性较馏分1RH又上升一个等级，对ABTS+·的清除能力较原油提高了75%。

表3 各馏分抗氧化活性富集程度评价

2.3 分子蒸馏富集柚皮精油抗氧化成分过程分析

为了更直观地显示分子蒸馏用于柚皮精油抗氧化成分富集的效果，分子蒸馏富集柚皮精油抗氧化成分过程分析如图3所示。图3汇总了二次分子蒸馏过程中所有馏分的主要抗氧化成分、D-柠檬烯的含量以及对ABTS+·的清除能力，两种抗氧化成分香叶醇和β-石竹烯的平均自由程分别0.019 cm和0.073 cm，均小于有效蒸发距离8.6 cm，因而未汽化部分直接沉降于馏分1RH中，而汽化部分冷凝至馏分1DM，极少出现在馏分1DL中，而宏量成分D-柠檬烯的平均自由程为9.1 cm，大于有效蒸发距离，只要将一级冷凝器温度控制在较高水平，大部分D-柠檬烯则被冷凝至馏分1DL，显然脱除宏量成分D-柠檬烯有利于活性成分的富集。对1RH的二次分子蒸馏的富集效果更加明显，两种抗氧化成分香叶醇和β-石竹烯的含量提高了1倍以上，活性也得到了显著提升，再次表明经多次分子蒸馏可以从植物精油中富集浓缩目标活性成分，实际上为植物精油的精制提供了一种非常有效的方法。

图3 分子蒸馏富集柚皮精油抗氧化成分过程分析

3 结论

植物精油种类繁多，用途广泛，具有极高商业开发价值，但精油原料的稳定性、生产的标准化等因素严重制约了其应用，我国在精油深加工及高附加值产品研发上还需加大力度。本研究以柚皮精油为实验材料，探索了结合GC-MS及活性分析的分子蒸馏技术用于精油抗氧化成分的分离富集，结果表明在分子蒸馏过程中如果能实时地监测主要活性成分的流向及活性的变化，并且在了解目标及杂质组分物性参数的前提下，设计多次特定分子蒸馏可以将精油中的有效成分进行有目的地富集。这种精准的分子蒸馏技术，虽无法取代昂贵的制备型气相色谱技术作为纯化方法，但因其低温、真空的操作条件及良好富集效率，有望成为植物精油精制的一种方法，拓展了分子蒸馏的用途，具有一定的商业化应用前景。