封闭式育肥猪舍内环境颗粒物对小鼠肺组织损伤的影响

陈冠希，刘 明，张宏福，郭振东，刘林娜，刘静波,*

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京102206；3.军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，吉林长春130122）

随着畜牧业机械化程度的提高，我国生猪养殖行业已逐步向规模化、集约化、标准化和自动化的现代养殖模式转型，生猪养殖效率显著提高。将猪舍内环境温度和湿度控制在适宜范围内是改善生猪生长性能的重要途径，而全封闭猪舍是实现舍内温度和湿度可控的主要手段。全封闭猪舍虽可显著提高生猪养殖的效率和密度，但通风不足时会导致舍内空气质量显著降低，而长期暴露于该环境下将会损害饲养人员和动物的健康以及动物的生长发育[1]。前期研究表明，封闭式畜禽舍内高浓度的有毒有害气体（如氨气和硫化氢等）会导致畜禽免疫力低下、食欲减退以及生长性能降低[2]。此外，饲养活动以及动物的自身活动会使畜禽舍内的大量粉尘微粒悬浮于空气中，悬浮的颗粒物与微生物结合之后形成微生物气溶胶[3]。具有不同颗粒大小的微生物气溶胶通过呼吸道进入动物的肺部和血液后可引发各种疾病，从而对动物生产造成显著的负面影响，且颗粒物直径越小危害越大[4]。

目前，长期处于规模化猪舍空气环境对人和家畜危害的研究在国内相对较少，猪场环境颗粒物对人和家畜机体的损伤效应研究尚不深入。因此本试验通过采集封闭式育肥猪舍内环境颗粒物样品，以小鼠为动物模型，采用滴鼻方式模拟动物呼入过程，用以研究猪舍环境颗粒物对小鼠肺组织损伤的影响，旨在对于家畜健康养殖及饲养员自我防护提供重要指导和借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 封闭式育肥猪舍环境颗粒物样品采集和洗脱 环境颗粒物样品采集于贵州省某规模化封闭式育肥猪舍内，将大容量空气采样器（华瑞核安）置于舍内中央位置，高度1.0 m，采样流量1 000 L/min，采集时间24 h。采样滤膜为石英膜（Pall，19.8 cm×23.8 cm），采样后将膜密封避光-20℃保存。舍内环境颗粒物总质量浓度根据称量采样前后膜质量差除以采样空气量计算，该猪场育肥舍的空气颗粒物质量浓度为1 934.8 μg/m3。使用去离子水在50 mL离心管中洗脱剪取的1/4采样膜，洗脱过程中将离心管置于冰上超声震荡20 min，使膜上的颗粒物样品充分洗脱融入溶液（图1）。

图1 封闭式猪舍内环境颗粒物样品采集及处理流程

1.2 试验设计与饲养管理 本试验采用单因子试验设计，将30只6周龄的BALB/C 雌性小鼠随机分成3个处理组，即对照组、生理盐水滴鼻组和颗粒物滴鼻组，每个处理10个重复。每日09:00用电子天平对小鼠进行称重后记录体重，09:30用乙醚轻度麻醉生理盐水滴鼻组小鼠后，用移液器吸取50 μL生理盐水滴入小鼠鼻腔，使其在自主呼吸状态下将生理盐水吸入肺中。与此同时，用乙醚轻度麻醉颗粒物滴鼻组小鼠后，使用移液器吸取50 μL颗粒物样品溶液滴入小鼠鼻腔，使其在自主呼吸状态下将样品溶液吸入肺中，每日小鼠吸入的颗粒物质量为696.5 μg。以小鼠呼吸量为60 mL/min计算[5]，每日滴入小鼠鼻腔样品量为小鼠呼吸4 d总悬浮物空气的质量，试验处理持续1周，模拟持续呼吸28 d总悬浮物空气的中长期暴露情况。

1.3 样品采集 于试验第3天和第7天11:00在每个组中随机选取5只小鼠采用尾静脉采血法采集小鼠足量血液用于血常规分析。采血后麻醉处死小鼠，解剖取肺部组织样品，用于制作病理切片和细胞因子mRNA表达量的测定。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 小鼠体况 根据试验期间每天记录的小鼠体重分析小鼠体重变化。

1.4.2 小鼠肺部病理变化 将肺部组织样品置于福尔马林溶液中，用于制作病理切片观察小鼠肺组织病理损伤。

1.4.3 小鼠肺部细胞因子表达 采用Trizol法提取肺部组织RNA，并反转录为cDNA，用于荧光定量PCR方法定量肺组织内肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN-γ）、白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、白介素-12（IL-12）等重要细胞因子表达情况。所定量基因及引物见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.4.4 血液常规生化指标测定 采用美国BACKMA COHIFER A4680全自动生化分析仪及相关配套试剂分析测定小鼠血液中白细胞数目、淋巴细胞数目、中间细胞数目、中性粒细胞数目、淋巴细胞百分比、中间细胞百分比、中性粒细胞百分比、血小板分布宽度、血小板压积、大血小板细胞比率、红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度变异系数、红细胞分布宽度标准差、血小板数目、平均血小板体积。

1.5 统计分析 数据采用SAS9.3统计软件分析均符合正态分布并进行单因素方差分析，用Duncan's法进行多重比较，数据结果以P＜0.05为差异显著，P＜0.10为有趋势。

2 结果与分析

2.1 封闭式育肥猪舍环境颗粒物滴鼻对小鼠体重的影响对照组、生理盐水滴鼻组和颗粒物滴鼻组小鼠的初始平均体重分别为19.3、19.3、19.0 g。由图2可知，试验期间，对照组和生理盐水滴鼻组小鼠体重稳步上升，在第7天，对照组小鼠平均体重上升6.6%，生理盐水滴鼻组小鼠平均体重上升4.5%。而颗粒物滴鼻组小鼠的体重先剧烈下降，至第3天达到最低（下降10.3%），随后逐步回升，第7天平均体重较初始体重下降2.2%。在第2～7天，颗粒物滴鼻组小鼠的体重均显著低于对照组和生理盐水滴鼻组（P＜0.05）。

图2 封闭式猪舍内环境颗粒物滴鼻对小鼠体重的影响

2.2 封闭式育肥猪舍环境颗粒物对小鼠肺组织病理影响如图3所示，对照组和生理盐水滴鼻组肺组织病理无明显变化。颗粒物滴鼻组小鼠第3天的肺组织病变明显，表现为弥漫性肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞肿胀，胞浆疏松，个别细胞坏死，肺泡结构几乎消失（a），在肺中弥散分布着坏死灶（b）。有大量的淋巴细胞和中性粒细胞弥漫性浸润在肺泡间质（c）。细支气管的上皮细胞变性坏死脱落、淋巴细胞和中性粒细胞阻塞细支气管（d），间质纤维轻度增生（e）。颗粒物滴鼻组第7天的小鼠肺组织病变明显，但较第3天病理变化轻微。弥漫性肺泡壁增厚，肺泡结构几乎消失，肺泡上皮细胞肿胀，胞浆疏松，个别细胞坏死（a）。有中度淋巴细胞和中性粒细胞弥漫性浸润在肺泡间质（c）。细支气管上皮细胞变性、坏死、脱落。少量淋巴细胞、中性粒细胞存在于细支气管中（d）。

图3 封闭式猪舍内环境颗粒物滴鼻对小鼠肺组织病理影响

2.3 封闭式育肥猪舍内环境颗粒物对小鼠肺部组织细胞因子mRNA表达的影响 如图4所示，在第3天，颗粒物滴鼻组小鼠肺组织内IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12表达水平显著高于对照组和生理盐水滴鼻组（P＜0.05），较对照组分别显著上调11.9、323.6、306.3、624.3、11.8倍。第7天，颗粒物滴鼻组小鼠肺组织内细胞因子TNF-α、IL-1、IL-4和IL-6较对照组和生理盐水组显著升高（P＜0.05），较对照组分别显著上调12.0、6.2、7.6、5.2倍。

2.4 封闭式育肥猪舍内环境颗粒物滴鼻对小鼠血液生化指标的影响 由表2、3可知，各处理组小鼠白细胞数目、淋巴细胞数目、中间细胞数目、中性粒细胞数目、淋巴细胞百分比、中间细胞百分比、中性粒细胞百分比、血小板分布宽度、血小板压积、大血小板细胞比率、红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度变异系数、红细胞分布宽度标准差、血小板数目、平均血小板体积无显著变化（P＞0.05）。

3 讨 论

图4 小鼠肺组织细胞因子相对表达量

猪场环境中含有多种气体、化学物质、颗粒物、细菌、粉尘等[6-8]，长期处于这样的环境会造成饲养人员和畜禽的机体损伤，同时也影响畜禽的生产水平。目前，针对各种有毒气体对动物生产性能影响的研究较多[9-10]，舍内颗粒物对动物机体损伤和生产性能的影响研究较少。在现代化养殖业中，封闭式猪舍内空气流速缓慢，使得猪舍内空气颗粒物浓度明显升高。呼吸系统作为机体与外界环境物质交换的门户受到威胁。颗粒物测定指标是可吸入颗粒物（PM10）以及细颗粒物（PM2.5），其危害程度主要取决于粒径大小、表面积以及化学组成。

本研究发现，封闭式育肥猪舍内空气颗粒物最高浓度可达1 934.8 μg/m3，该质量浓度远远超过《国家空气质量标准》[11]中总悬浮颗粒物浓度的二级标准300 μg/m3。以含有该颗粒物浓度的溶液滴鼻感染小鼠，小鼠在前3 d反应剧烈，呈现急性炎症反应，体重骤减，随后机体逐渐适应该成分转为慢性炎症反应，体重有所回升，但仍明显低于正常小鼠体重。

本试验结果表明，在第3天，颗粒物滴鼻组小鼠肺组织内IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12表达水平较对照组分别显著上调11.9、323.6、306.3、624.3、11.8倍；在第7天，颗粒物滴鼻组小鼠肺组织内细胞因子TNF-α、IL-1、IL-4和IL-6较对照组和生理盐水组显著升高，分别是对照组的12.0、6.2、7.6和5.2倍。TNF-α具有促炎症反应发生发展并调节自身免疫反应的功能，譬如炎性骨吸收、程序性细胞死亡和自身免疫疾病等[12]，已被证明与慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合症等肺部疾病发病有一定关系[13]，在肺急性呼吸窘迫综合征和肺癌组织中明显上调表达[14-15]。IL-6在炎症反应中作为重要递质起核心调节作用，有研究报道表明大气PM2.5成分可以显著刺激鼠肺组织中IL-6的超表达，并且PM2.5可以通过IL-6通路上调肺上皮细胞ICAM-1的表达[16]。与TNF-α和IL-6不同的是，IL-10是一种抗炎症与免疫抑制细胞因子。在颗粒物滴鼻后第3天，小鼠肺内TNF-α、IL-6和IL-10同时超表达，说明肺组织免疫系统紊乱、损伤严重。上述结果与病理学观察结果一致，颗粒物滴鼻组的小鼠肺部病变在第3天较第7天严重，有中度淋巴细胞和中性粒细胞弥漫性浸润在肺泡间质，出现明显的炎症反应，细支气管上皮细胞出现坏死，肺中弥散分布着坏死灶。本试验中，颗粒物滴鼻组小鼠肺部出现明显的炎症反应，然而小鼠血液中的炎症细胞数量没有明显变化，可能是因为颗粒物损伤肺部引发流血产生细胞因子，循环血中炎症细胞数量不能直接反映局部炎症反应。

表2 试验第3天小鼠血液生化指标

表3 试验第7天小鼠血液生化指标

4 结 论

试验证明，封闭式育肥猪舍内环境颗粒物对小鼠机体有明显的损伤作用。将封闭式育肥猪舍环境颗粒物滴鼻对小鼠体重有显著影响；而且对肺组织有明显的病理损伤及炎症反应，肺组织重要细胞因子mRNA表达显著上调，长期处于如此高浓度空气颗粒物质量浓度的空气环境中容易引发多种肺部疾病。