丙氨酰-谷氨酰胺预处理对氧化应激猪小肠上皮细胞活力和自噬的影响

辛向荣，贺 琴，游金明，叶亚玲，邓宸玺

（江西农业大学动物科技学院，江西省动物营养重点实验室，江西省营养饲料开发工程中心，江西南昌330045）

谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是肠道细胞进行细胞周转的能量底物[1]，是嘌呤和蛋白的氮源供体，用来维持依赖于ATP的代谢过程的顺利进行。Gln代谢产生的鸟氨酸是多胺合成的重要前体，而多胺是一种脂肪组胺类，在IPEC-1的分化、增殖及受损肠道上皮修复等过程中发挥重要作用[2-3]。研究发现，添加Gln能保护肠道上皮紧密连接蛋白，防止肠道氧化损伤，并刺激蛋白质合成和细胞增殖[4-6]，Gln对维持断奶仔猪肠道正常形态、结构和功能，缓解断奶应激损伤具有重要作用[7-9]。但Gln溶解度低，具有热不稳定性，影响了其在动物生产上的应用[10]。丙氨酰-谷氨酰胺（Alanyl-Glutamine Dipeptide，Ala-Gln）被吸收后可迅速释放Gln，可以解决Gln的应用问题。此外， Ala-Gln已成为人类营养研究领域中的热点，在全肠外营养中的研究日益成熟，这为Ala-Gln在畜禽饲料中应用提供了理论支撑[11-12]。自噬（Autophagy）可以定义为细胞“自食”的一个过程，细胞依赖溶酶体降解受损蛋白、损伤或衰老的细胞器等细胞结构，可被多种应激所触发[13-14]。这是机体面对新陈代谢应激进化出的一种防御反应。当处于营养缺乏状态时细胞通过自噬作用回收降解后胞质蛋白，并利用非必需细胞器分解提供代用能源[15]。本研究旨在通过检测IPEC-1细胞活力、抗氧化酶活力及丙二醛（MDA）含量，免疫荧光技术检测氧化应激状态IPEC-1的自噬程度，研究H2O2诱导氧化应激状态下不同浓度的Ala-Gln对IPEC-1的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本试验采用的Ala-Gln购自上海超强化工有限公司，纯度≥99%。猪小肠上皮细胞IPEC-1由中国科学院长沙亚热带农业生态研究所提供。

1.2 氧化应激模型的建立 试验采用单因子试验设计，37℃、5% CO2培养箱中培养细胞24 h后，弃去培养液。加入DMEM完全培养液（不含Gln和血清），再分别向每个复孔中添加0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L Ala-Gln预处理20 h。后利用H2O2诱导细胞构建氧化应激模型（前期试验确定最佳应激模型为400 μmol/L H2O2作用4 h），试验共设6个处理，每个处理8个重复。模型建立后开始以下试验数据的测定。

1.3 MTT法检测细胞活力 各复孔均加入100 μL浓度为1 mg/mL的MTT，培养4 h后，倒掉上清液，加入150 μL的二甲基亚砜，震荡混匀10 min。用酶标仪检测490 nm处每孔的吸光度。

1.4 细胞抗氧化酶活性和MDA含量的检测 将细胞培养板内上清液去除，加入细胞裂解液100 μL，混匀37℃孵育2 min，待测其中MDA含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活力。采用南京建成生物工程研究所的MDA试剂盒（货号A003-4）、GSH-Px试剂盒（货号A005）和SOD试剂盒（货号A001-3），按操作说明要求检测培养液中SOD和GSH-Px活力及MDA含量。

1.5 LC3-II的免疫荧光定量分析 用PBS洗涤细胞5次（10 min/次），加入4%多聚甲醛室温下固定15 min。固定后的细胞用PBS洗涤，100%甲醇-20℃透明10 min，透明后PBS洗涤，之后室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液封闭1 h。然后将细胞与抗LC-3抗体一起在抗体稀释液（1:50 5% BSA）中4℃培养过夜。经过3次TBST洗涤，再将细胞与FITC-anti-Rabbit抗体在抗体缓冲液（1:100 5% BSA）中37℃培养1 h。然后马上用TBST洗涤3次（5 min/次），蒸馏水漂洗1次。取出盖玻片，甘油封片处理，荧光显微镜观察拍照。

1.6 统计分析 采用SPSS 17.0分析软件中ANOVA程序对所测指标进行单因素方差、线性和二次型分析，并用Duncan´s法进行差异显著性比较。结果用平均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞活力的影响 如图1所示，氧化状态下，随Ala-Gln添加水平的提高，IPEC-1细胞活力显著增强（P＜0.05），且在Ala-Gln为2.00 mmol/L时达到最大值。4.00 mmol/L Ala-Gln水平反而使细胞活力显著下降（P＜0.05），但仍高于0.25、0.50、1.00 mmol/L Ala-Gln下IPEC-1细胞活力。

图1 Ala-Gln对氧化应激状态IPEC-1细胞活力的影响

2.2 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞抗氧化性能的影响 由表1可知，添加Ala-Gln预处理细胞，显著提高了氧化应激状态IPCE-1 GSH-Px和SOD活性（P＜0.05），显著降低了MDA含量（P＜0.05）。氧化应激状态下IPEC-1 GSH-Px活性随Ala-Gln添加浓度增加而提高，而SOD活性在Ala-Gln预处理水平为0.25 mmol/L和0.50 mmol/L时活性最高，之后随Ala-Gln添加水平提高而降低。氧化应激状态下IPEC-1中MDA含量随Ala-Gln预处理水平提高而降低。

表1 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞抗氧化性能的影响

2.3 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞自噬蛋白LC3-II的影响 由图2可观察到，阳性荧光信号为LC3-II，其为自噬体的标志蛋白，代表自噬发生。对照组细胞未经H2O2处理，细胞结构完整，排列紧密，个别细胞出现阳性荧光信号，为IPEC-1正常细胞生理状态。当加入H2O2诱导氧化应激后（图2-A），IPEC-1细胞密度短时间降低，且细胞膜和核膜严重破损，加速外渗细胞质到培养基中，细胞核几乎消融，且胞内很少出现阳性荧光信号，IPEC-1细胞逐渐死亡；当在培养基中加入Ala-Gln预处理后，随Ala-Gln添加水平提高IPEC-1生物膜结构趋于完整，胞内细胞质和核内遗传物质得到很好的保护，细胞密度也随之提高，细胞质中阳性荧光信号增强，当Ala-Gln预处理量为4.00 mmol/L时，细胞生理结构同正常对照组相比无显著差异，与Ala-Gln预处理量为2.00 mmol/L时细胞相比，胞内荧光信号有减少趋势。

3 讨 论

3.1 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞抗氧化性能的影响 Gln是体内重要的抗氧化剂，其作为重要的免疫增强因子，对维持内环境氧化和还原稳态起到重要作用[16]。研究发现，细胞培养基中添加Gln可减缓脂多糖或H2O2引起的氧化应激[5]。Gln主要通过减少氧化应激下的细胞凋亡，增强抗氧化酶防御作用、热休克蛋白的表达及诱导细胞自噬来发挥作用[17]。Gln兼备免疫调节与抗氧化能力，这为在临床营养治疗中的应用开辟了广阔的应用空间。

前期研究发现，400 μmol/L的H2O2可显著降低IPEC-1的活力，显著降低IPEC-1内GSH-Px和SOD酶的活性，显著提高细胞内脂质过氧化产物MDA含量[18]。本试验中预添加不同水平Ala-Gln后IPEC-1细胞活力显著增强，且添加2.00 mmol/L Ala-Gln时氧化应激状态下IPEC-1细胞活力达到最大值，当Ala-Gln添加量为4.00 mmol/L时，细胞活力显著下降，但仍高于0.50、1.00 mmol/L Ala-Gln预处理过的IPEC-1细胞活力，该结果与席鹏彬等[19]研究结论相似。

图2 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞自噬蛋白LC3-II的影响

3.2 Ala-Gln预处理对诱导氧化应激猪小肠上皮细胞自噬蛋白LC3-II的影响 氧化应激能够造成IPEC-1内自由基的大量堆积，其中对生物膜上多不饱和脂肪酸过氧化损伤最为严重。从本试验免疫荧光结果中可以看出，氧化应激状态小肠上皮细胞的细胞膜和核膜发生脂质过氧化，使其流动性降低，通透性极大提高，胞内有机物质加速外渗，蛋白和核酸氧化变性，失去正常生理功能，IPEC-1死亡率极大提高，细胞密度显著降低。研究发现，Ala-Gln具有抗氧化应激能力，并且是细胞周转的主要燃料和氮源供体，在受损肠道上皮修复等过程中发挥重要作用[10,20-21]。IPEC-1细胞培养基中缺乏Gln 8 h内，会降低IPEC-1细胞数量，增加细胞自噬体的数量，并增强细胞LC3B-II的表达[22]。细胞发生自噬过程的特征在于所谓双膜囊结构自噬体的形成，这种结构由Atg12-Atg5-Atg16复合体和微管结合蛋白轻链3（LC3-I）-磷脂轭合物（LC3-II）介导[17,23]。Sakiyama等[17]研究发现，Gln能够增加肠上皮细胞内微管结合蛋白轻链3-磷脂轭合物（LC3-II）的数量，提高细胞内自噬体数量，同时能够通过控制mTOR和p38 MAP激酶通路来诱导细胞自噬，保护生理应激状态细胞。自噬对机体起保护作用，还是对机体造成危害，取决于机体所处的生理条件[24]。

本试验发现，细胞受到氧化应激使得IPEC-1细胞密度短时间降低，且细胞膜和核膜严重破损，加速外渗细胞质到培养基中，细胞核几乎消融，细胞死亡导致仅能从个别细胞中观察到自噬体。而Ala-Gln预处理后的细胞，IPEC-1生物膜结构趋于完整，胞内细胞质和核内遗传物质得到很好保护，细胞密度也随之提高，其中Ala-Gln添加水平为1.00 、2.00 mmol/L时，IPEC-1胞内自噬体较多，细胞趋于完整状态。当Ala-Gln预处理量为4.00 mmol/L时，细胞生理结构同正常对照组相比无显著差异，且与Ala-Gln预处理量为2.00 mmol/L时的细胞相比，胞内荧光信号有减少趋势。这可能是由于随着应激状态缓解，自噬体降低，细胞逐渐恢复为正常状态。

根据本试验结果可推测，当IPEC-1遭受氧化应激时，Ala-Gln能够通过提高抗氧化物酶活性，减少生物膜上脂质过氧化的发生，保护脂质双分子层结构，使膜的流动性和通透性不变，进而维持细胞中蛋白和核酸正常生物功能。而另一方面，在氧化应激生理条件下，Ala-Gln的添加使得细胞中自噬体增加，细胞通过自噬作用利用胞浆内受损的蛋白和细胞器等细胞结构，为抗氧化物酶的表达与合成提供原料和能量，增强营养缺乏状态时细胞防御能力，缓解细胞受到氧化应激的损伤。

4 结 论

本试验研究发现，预添加不同水平的Ala-Gln可显著提高氧化应激状态下IPEC-1细胞中GSH-Px、SOD酶活性，显著降低脂质过氧化产物MDA含量，增强细胞自噬以缓解细胞氧化应激，表明Ala-Gln对氧化应激状态下IPEC-1具有较强的抗氧化和细胞防御作用。