乳腺癌组织中Snail、Bcl-2的表达水平及其临床意义

刘平贤，张浩，李伟汉

（河南省南阳市中心医院，河南 南阳 473009）

据有关数据显示，每年约120万女性确诊为乳腺癌，死亡人数约45万，乳腺癌已成为威胁全球女性健康最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前，手术切除仍然是治疗乳腺癌的主要手段，基于组织病理学诊断结果不仅有助于了解患者的病理特征，而且有利于对患者预后进行准确判断。但是临床资料显示，相同病理结果患者其治疗及预后差异较大。有文献报道称，由于乳腺癌的高度异质性，即使存在完全相同的组织形态学结构，其分子遗传内容的改变也未必相同，这可能是患者治疗效果差异的原因之一[2]。探讨与浸润、转移及无限增殖有关的蛋白分子改变具有重要意义。研究发现，Snail可调节肿瘤细胞上皮间质化，促进细胞转移[3]。B淋巴细胞白血病-2（B-cell lymphorma-2,Bcl-2）基因是肿瘤细胞重要的抗凋亡基因[4]。但是目前关于Snail与Bcl-2是否存在一定关系的报道较少。因此，本研究通过分析2010～2015年在河南省南阳市中心医院治疗并有完整随访记录的患者的病理特征及预后，结合Snail和Bcl-2蛋白表达水平，为进一步了解乳腺癌的发病机制，探索新的治疗方法提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年4月-2015年5月于本院实施手术切除的92例乳腺癌患者作为研究对象，获取乳腺癌石蜡组织标本92例，癌旁组织标本92例，癌旁组织距手术边缘＞3 cm。根据TNM分期标准，Ⅰ、Ⅱ期57例，Ⅲ期35例。根据肿瘤组织分化情况，中、高分化50例，低分化42例。纳入标准：①病理结果显示浸润性导管癌；②术前未放化疗；③近3个月内未服用激素类药物；④完整的病例资料及随访记录。排除标准：①合并有其他肿瘤；②生存期＜3个月；③存在糖尿病等慢性消耗性疾病。患者的病理资料中，如乳腺癌组织类型雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）、ki-67及人类表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2,Her-2）免疫组织化学结果均由本院高年资病理医师给出。本研究经本院伦理委员会批准，患者均知情并签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人Snail单抗、兔抗人Bcl-2单抗及羊抗兔多抗（英国Abcam公司），二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），Ti型荧光显微镜（上海尼康仪器有限公司），TC-150型自动脱水机、TB-718型自动包埋机及TK-218V恒温摊片机型（孝感市湖北泰维医疗科技有限公司）。

1.3 免疫组织化学法

病理组织经10%甲醛固定、脱水、透明及透蜡后进行石蜡包埋、切片，厚5～6μm，依次进行脱蜡、复水、抗原修复、灭活过氧化氢酶及封闭步骤后，分别加入Snail单抗（1∶30稀释）或Bcl-2单抗（1∶50稀释），37℃孵育1 h，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤后加入羊抗兔多抗（1∶1 000稀释），37℃孵育1 h，PBS洗涤后加入辣根过氧化物，37℃孵育10～20 min，PBS洗涤后加入DAB显色液，自来水冲洗并进行苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片观察。以PBS为抗体阴性对照。

1.4 免疫结果判断

由于Snail和Bcl-2均表达于细胞质中，免疫组织化学法结果可显示棕黄色或棕褐色。结果由2位未直接参与本研究的病理医生在双盲情况下阅片，根据阳性细胞数目和染色程度进行评分：①阳性细胞数≤5%计0分，＞5%～25%计1分，＞25%～50%计2分，＞50%～75%计3分，＞75%～100%计4分；②染色程度:未见阳性细胞计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最终得分=阳性细胞数目得分×染色程度得分，得分＜5分为低表达，≥5分为高表达。患者Snail高表达60例，低表达32例；Bcl-2高表达39例，低表达53例。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计学分析，计数资料以率（%）或构成比表示，比较用χ2检验，生存曲线分析采用Kaplan-Meier法中的Log-rank χ2检验，相关性分析采用Pearson法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌及癌旁组织中Snail与Bcl-2蛋白表达水平

乳癌癌组织中Snail高表达率为62.5%（60/92），Bcl-2低表达率为57.6%（53/92），癌旁组织中Snail高表达率为39.1%（36/92），Bcl-2低表达率为34.8%（32/92），两者的Snail和Bcl-2表达率比较，差异有统计学意义（χ2=12.554和9.643，P=0.014和0.046），乳腺癌组织中Snail与Bcl-2表达水平呈负相关（r=-0.519，P=0.021）。见图 1。

图1 乳腺癌及癌旁组织中Snail与Bcl-2的表达情况

2.2 Snail表达水平与临床病理特征的相关性

Snail表达水平与病理分期、肿瘤大小及HER-2无相关性（P＞0.05），与组织学分级、淋巴结是否转移、雌激素受体（estrogen receptor, ER）及孕激素受体（progesterone receptor, PR）表达有相关性（P＜0.05）。见表1。

表1 Snail表达水平与临床病理特征的相关性

2.3 Bcl-2表达水平与临床病理特征的相关性

Bcl-2表达水平与病理分期、组织学分级、淋巴结转移及HER-2表达无相关性（P＞0.05），与肿瘤大小、ER及PR有相关性（P＜0.05）。见表2。

表2 Bcl-2表达水平与临床病理特征的相关性

2.4 Snail对乳腺癌患者预后的影响

低表达Snail乳腺癌患者中，骨转移2例，肝转移2例，无瘤生存率为87.5%（28/32）；高表达Snail乳腺癌患者中，骨转移3例，肺转移2例，脑转移2例及肝转移6例，无瘤生存率为78.3%（47/60），两者无瘤生存率比较，差异有统计学意义（χ2=4.553，P=0.042）。低表达Snail患者死亡1例，高表达Snail患者死亡5例，两者生存率比较，差异有统计学意义（χ2=5.642，P=0.036）。见图2。

图2 高、低表达Snail患者的生存曲线

2.5 Bcl-2对乳腺癌患者预后的影响

高表达Bcl-2乳腺癌患者中，骨转移2例，肝转移3例，无瘤生存率为87.2%（34/39）；低表达Bcl-2乳腺癌患者中，骨转移3例，肺转移2例，脑转移2例，肝转移5例，无瘤生存率为77.4%（41/53），两者无瘤生存率比较，差异有统计学意义（χ2=6.542，P=0.032）。低表达Bcl-2患者死亡5例，高表达Bcl-2患者死亡1例，两者生存率比较，差异有统计学意义（χ2=7.215，P=0.028）。见图3。

图3 高、低表达Bcl-2患者的生存曲线

3 讨论

临床数据显示，目前我国乳腺癌发病率已位居女性癌症第1位，其发病率约为万分之四，且每年以3%的速度逐年增加，并呈现年轻化趋势[5]。而随着对乳腺癌发病机制的深入了解以及分子诊断学技术的发展，已证实乳腺癌术后复发与转移可受到肿瘤微环境、机体免疫功能及遗传等多因素调节，并涉及多基因及多条信号通路。其中Snail与Bcl-2是目前研究乳腺癌转移及复发的重要调控因子。由于Snail可通过上调波形蛋白、成纤维细胞特异蛋白和Rho蛋白表达或下调钙粘附蛋白E表达等途径导致肿瘤上皮间质化并促进肿瘤转移的发生，因而Snail高表达往往意味着肿瘤转移风险较大，且患者预后不良[6]。Bcl-2蛋白则与Bax蛋白同时表达于正常的乳腺上皮细胞，且两者表达水平处于动态平衡中，但乳腺癌组织中多呈现Bcl-2过表达[7]。由此笔者推测Bcl-2/Bax失衡或将导致机体无法及时清除变异的异常细胞，从而为肿瘤的形成或复发提供条件。而采用药物抑制Bcl-2蛋白活性，诱导肿瘤凋亡并最终起到杀死肿瘤细胞便是根据Bcl-2的作用机制。

由于肿瘤增殖及转移在一定程度上或许存在某种联系，而以往研究中又多将Snail与Bcl-2作为研究肿瘤转移的重要调控基因或关键的药物靶点，较少涉及到两者相关性或两者与肿瘤病理特征及预后关系。但深入了解以上问题，不仅有利于对药物治疗效果的正确评价，还有助于提前制定合理的治疗手段，从而提高乳腺癌治疗效果及生存率。因此，本研究首先针对乳腺癌组织及癌旁组织中Snail及Bcl-2的表达水平差异进行分析。其结果显示，Snail及Bcl-2在不同组织中的表达水平有差异，且Snail与Bcl-2表达水平在乳腺癌组织中呈现负相关性。研究显示，钙黏附蛋白E是肿瘤上皮间质化的直接调控蛋白，而低分化、高恶性程度的肿瘤组织中往往低表达钙黏附蛋白E，且Snail又可负性调节钙黏附蛋白E，因而，高表达Snail的肿瘤组织或许易发生肿瘤上皮间质化及肿瘤转移[8]。但是，作为抗凋亡基因Bcl-2，虽然其在乳腺癌组织及癌旁组织中表达存在差异，但Bcl-2在乳腺癌组织并非高表达，而SMERAGE等也证实，高表达Bcl-2与患者预后具有正相关性[9]。其可能原因是Bcl-2不仅抑制细胞凋亡，也延缓了细胞周期及分裂次数，从而对细胞增殖产生负性作用[10]。而这或许解释了Snail与Bcl-2存在负相关性的可能性之一，即细胞增殖或许有利于细胞上皮间质化的发生[11]。

随后，本研究按临床病理特征对乳腺癌患者分组，并探讨不同情况分组下Snail与Bcl-2的表达情况。其结果显示，Snail与组织学分级、淋巴结转移与否以及ER、PR表达存在相关性。由于Snail与肿瘤细胞侵袭能力存在正相关性，而病理分期则是以癌组织浸润程度为判断依据之一，而癌组织浸润程度越高，其发生癌细胞转移的几率也大大增加，因而也更易出现淋巴结转移。此外，三阴性乳腺癌（ER-/PR-/HER-2-）具有侵袭性强、癌细胞易转移及预后较差等特点，而从本研究结果可知，Snail与ER及PR均存在负相关性，但Snail与HER-2无明显相关性，基本与以往报道相符合[12]。其可能存在机制为内分泌激素影响肿瘤微环境，从而对Snail调节钙黏附蛋白E通路产生影响[13]。此外，Bcl-2与肿瘤大小、ER及PR存在相关性。由于肿瘤变大多伴随肿瘤细胞大量增殖，而此类癌细胞多低表达或不表达Bax，而高表达Bcl-2[14]。MARTIN等[15]研究发现Bcl-2高表达患者多为ER+或/和PR+，但其具体作用机理仍有待进一步分析。另外，高表达Snail或低表达Bcl-2患者的无瘤生存期及生存率均低于低表达Sanil或高表达Bcl-2患者。结合其病理特征分析，笔者猜测如下原因：①Snail低表达及Bcl-2高表达多为雌/孕激素受体阳性患者，而这类患者进行内分泌治疗效果较好；②病理早期、未发生淋巴转移或肿瘤较小患者采取手术治疗效果较好。

综上所述，Snail及Bcl-2不仅存在一定负相关性，且在一定程度上均可反应患者病理特征及其预后，不仅可作为治疗乳腺癌的药物靶点，也可作为乳腺癌的诊断指标之一。但鉴于本研究纳入样本数较少，后续还需进行多样本，随机双盲实验，以便获得更加可信的结论。