断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮发育的影响

孙大明，李弘伟，毛胜勇，刘军花

(江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，南京农业大学消化道微生物研究室，江苏 南京 210095)

瘤胃是反刍动物重要的消化器官，新生羔羊瘤胃内壁光滑、颜色浅，随日龄的增加和固体饲料的采食，瘤胃壁逐渐增厚、乳头增长、瘤胃发酵功能逐渐建立[1]。同时，幼龄时期是动物胃肠道迅速发育的时期，其发育状况对成年后的机体健康及生产性能具有重要影响[2]。所以在反刍动物幼龄期调节瘤胃的发育显得尤为重要。研究表明尽早补饲开食料可以促进羔羊瘤胃发育，在实际生产中，犊牛和羔羊一般在出生后的7～10 d开始补饲高淀粉含量的开食料以促进羔羊瘤胃的发育。

淀粉是开食料中的重要成分，而淀粉在瘤胃中的降解受诸多条件的影响，如直链淀粉比例，淀粉结晶度和淀粉颗粒结构等[3]。Stevnebo等[4]通过体外研究发现淀粉中支链淀粉比例与淀粉的降解率呈显著正相关。Ren 等[5]也发现高支链淀粉比例的淀粉在瘤胃中降解率比较高。研究表明，不同来源淀粉中直/支链淀粉比不同，在瘤胃中的降解率也不同，如木薯(Manihotesculenta)、水稻(Oryzasativa)和小麦(Triticumaestivum)支链淀粉含量较高，在瘤胃中的发酵率较高；豆类淀粉，尤其是豌豆(Pisumsativum)支链淀粉含量较低，在瘤胃内的降解率较低[6-7]。Lesmeister等[8]研究发现，与饲喂含有细磨玉米的开食料相比，犊牛饲喂含有易发酵蒸汽压片玉米的开食料更能有效地促进瘤胃上皮的发育。所以推测羔羊饲喂不同直/支链淀粉开食料会影响羔羊瘤胃上皮的发育。本研究的主要目的将从形态及分子水平研究不同直/支链淀粉开食料对羔羊瘤胃上皮发育的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计与动物饲养

试验于2015年10-12月在江苏省苏州市湖羊种羊场进行。试验选取24只体况良好、胎次一致、体重相近的初生羔羊(湖羊)，将其随机分为木薯淀粉组(cassava starch，CS，n=8)、玉米(Zeamays)淀粉组(maize starch，MS，n=8)和豌豆淀粉组(pea starch，PS，n=8)(直/支链淀粉比分别约为0.11，0.27和0.44)。从10日龄开始，每天4:00-19:00将羔羊抱入补饲栏与母羊分离，各组羔羊自由采食不同直/支链淀粉比的开食料。其间在6:30, 10:30和15:30将羔羊抱回母羊舍哺乳1 h。试验期间，羔羊自由饮水，单栏饲喂，自由采食燕麦干草，每周监测羔羊体重变化及临床参数变化。当羔羊每天可以采食200 g干物质开食料时不再继续增加开食料的量，并且所有羔羊在屠宰前7 d时均能每天采食200 g干物质开食料。不同直/支链淀粉比开食料配方依据湖羊开食料营养需要标准(NY/Y816-2004; 中华人民共和国农业部, 2004)设计(表1)。

1.2 样品采集

羔羊56 日龄时，晨饲2 h后屠宰采样，采集三部分腹囊部的瘤胃组织块，并在冰的磷酸缓冲盐溶液里清洗3次，一部分用钝物将浆膜层和肌肉层分离得到瘤胃上皮，剪成约0.5 cm×0.5 cm的小碎块置于液氮保存，用于RNA的提取；一部分修剪成1.0 cm×1.0 cm的组织块置于4%多聚甲醛(Sigma，美国)溶液中用于组织形态学分析；一部分修剪成1.0 cm×1.0 cm的组织块置于冰上用于瘤胃乳头长度、宽度和个数的测定。

1.3 淀粉含量测定

开食料中总淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量采用总淀粉试剂盒和直/支链淀粉试剂盒测定(Megazyme，爱尔兰)。

1.4 瘤胃上皮形态学测定

放在冰上的瘤胃组织块(1.0 cm×1.0 cm)当天用于测定瘤胃乳头个数，然后每个样品随机选择15个瘤胃乳头用电子数显游标卡尺(三丰，日本)测量每个瘤胃乳头的长度和宽度。将固定在4%多聚甲醛的瘤胃组织做石蜡切片，苏木精和伊红染色，切片厚度为6 μm，用于瘤胃乳头上皮各层厚度的测量。在进行组织形态学分析时采用盲检的方法，在40×物镜下选择每个样本的5个完整瘤胃乳头进行测量。运用Image Pro Plus软件进行测量，瘤胃上皮各层厚度的测量参照Steelo等[9]的方法。角质层定义为最外面的染色较重含有细胞质残留物但没有细胞核的细胞层；颗粒层为长轴型细胞，染色较浅并与棘状层和基底层垂直；棘状层和基底层没有明显的分界线将其定义为位于颗粒层和固有层之间的细胞层。

1.5 RNA的提取和cDNA的合成

瘤胃上皮总RNA的提取参照Chomczynski等[10]的方法。使用微量核酸蛋白测定仪(Thermo，美国)测定RNA的浓度和纯度。所有样品的吸收比例都为1.96～2.08， 证明RNA纯度较高。 用1.4%的琼脂糖胶检测RNA的完整性。将所有的RNA浓度调整到0.5 μg·μL-1置于-80 ℃冰箱保存备用。利用含基因组RNA酶的反转录试剂盒(Takara生物，日本)进行cDNA的合成。

表1 开食料饲料成分和营养水平表 (干物质基础) Table 1 Ingredient and nutrient composition of the starter diet (dry matter basis)

注：1预混料每kg饲粮提供：Zn 102 g，Mn 47 g，Cu 26 g，I 1140 mg，Se 500 mg，Co 340 mg，维生素A 17167380 IU，维生素D 858370 IU，维生素E 23605 IU；2该数值是基于NRC (2007)数据库的计算值；3该数值是实际测量值。

Note：1Contained 102 g·kg-1of Zn, 47 g·kg-1of Mn, 26 g·kg-1of Cu, 1140 mg·kg-1of I, 500 mg·kg-1of Se, 340 mg·kg-1of Co, 17167380 IU·kg-1of vitamin A, 858370 IU·kg-1of vitamin D, and 23605 IU·kg-1of vitamin E;2Values were analyzed based on database of the NRC (2007);3The actual values for measurement.

1.6 引物的合成和实时定量PCR

利用Q5 Real-time PCR仪(Applied Biosystems，美国)对细胞周期蛋白、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor，IGF-1)及内参基因GAPDH进行定量，GAPDH引物序列参照Wang等[11]的方法，实时定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0软件自行设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表2。SYBR购自Takara公司，反应条件为：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。反应体积20 μL：10.4 μL SYBR，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，2 μL样品cDNA以及6.8 μL无菌水。所有样品设3个重复。目的基因的相对表达量以管家基因GAPDH作为内参进行校正，数据分析采用2-ΔΔCT的方法。

表2 qRT-PCR基因引物序列Table 2 Primers for quantitative real time PCR

1.7 数据处理

结果以平均值±标准误(means±SEM)进行表示。采用SPSS 20.0中的单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性分析，采用Turkey法进行多重比较。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 生产性能及临床症状观察

所有羔羊在试验期内未发生明显的临床症状。CS、MS和PS组羔羊的初生重[(3.31±0.11),(3.48±0.13),(3.35±0.12) kg，P=0.594]无显著性差异，56日龄体增重[(11.56±0.69),(11.13±0.31),(10.29±0.40) kg，P=0.204]也无显著差异。

2.2 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃乳头形态的影响

3种不同直/支链淀粉比开食料显著影响了羔羊瘤胃乳头形态(表3)。CS组羔羊瘤胃乳头长度和吸收表面积显著(P<0.001)高于MS和PS组，CS和MS组羔羊瘤胃乳头宽度显著(P=0.001)高于PS组，3组羔羊瘤胃乳头密度无显著差异(P=0.114)。对瘤胃上皮各层厚度统计显示，CS和PS组羔羊瘤胃上皮角质层厚度显著(P=0.001)高于MS组；CS和MS组羔羊瘤胃上皮颗粒层厚度显著(P<0.001)高于PS组；CS组羔羊瘤胃上皮棘基层厚度和总厚度显著(P<0.001)高于MS和PS组。

2.3 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮细胞周期蛋白mRNA表达量的影响

CS组羔羊瘤胃上皮细胞cyclinA(P=0.013)和CDK4(P=0.016)的mRNA表达量显著高于PS组(图1)，但和MS组无显著差异；CS组羔羊瘤胃上皮细胞CDK2和CDK6的mRNA表达量显著高于MS和PS组(CS>MS>PS，P<0.001)； CS组羔羊瘤胃上皮cyclinD1的mRNA表达量显著(P=0.012)低于PS组，但和MS组无显著差异；3组羔羊瘤胃上皮cyclinE的mRNA表达量无显著差异(P=0.353)。

表3 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮形态和各层厚度的影响Table 3 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on papillae morphology and the thickness of different stratum of rumen epithelium in pre-weaned lambs

图1 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮细胞周期蛋白mRNA表达量的影响Fig.1 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on cell cycle protein mRNA expression of rumen epithelium in pre-weaned lambs 不同字母表示平均值有显著差异(P<0.05)。下同。Different letters are significantly different (P<0.05). The same below.

图2 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮IGF-1和IGF-1R的mRNA表达量的影响Fig.2 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on the IGF-1 and IGF-1R mRNA expression of rumen epithelium in pre-weaned lambs

2.4 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮IGF-1和IGF-1R的mRNA表达量的影响

CS组羔羊瘤胃上皮IGF-1的mRNA表达量显著(P<0.001)高于MS和PS组(图2)，CS和MS组羔羊瘤胃上皮IGF-1R的mRNA表达量显著(P=0.001)高于PS组。

3 讨论

3.1 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃乳头形态的影响

瘤胃是反刍动物重要的消化器官，羔羊时期瘤胃的发育状况对成年后的机体健康及生产性能具有重要影响[12]。Khan等[13]研究发现，与含有较高直链淀粉的燕麦(Avenasativa)和大麦相比，含有较低直链淀粉的小麦和玉米淀粉开食料更能促进犊牛瘤胃乳头的发育，主要包括增加瘤胃乳头的长度和宽度。同样，本研究发现，含有较低直链淀粉的木薯淀粉开食料组增加了羔羊瘤胃乳头的长度、宽度和表面积。同时，切片结果显示，木薯淀粉开食料显著增加了羔羊瘤胃上皮角质层、颗粒层、棘基层和总上皮的厚度。以上结果表明，木薯淀粉开食料更好地刺激了羔羊瘤胃乳头的发育。

3.2 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮细胞周期蛋白mRNA表达量的影响

以上研究结果表明,饲喂含有较高支链淀粉的木薯淀粉开食料显著促进了羔羊瘤胃上皮的发育。为了研究木薯淀粉开食料促进瘤胃上皮发育的机制，对瘤胃上皮细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的mRNA表达量进行分析。细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，主要包括静止期(G0期)、分裂间期(G1、S和G2期)和有丝分裂期(M期)。细胞周期的推进主要受细胞周期蛋白(cyclins)及其相关激酶(cyclin dependent protein kinases, CDKs)的调控。本试验研究发现木薯淀粉开食料显著促进了瘤胃上皮cyclinE，CDK2，CDK4和CDK6的mRNA表达。研究表明，cyclinD1和cyclinE表达升高均能导致细胞周期G1期进程加快[14]。Filmus等[14]研究发现cyclinD1或cyclinD1-CDK4/CDK6复合物的表达升高有利于缩短大鼠小肠上皮细胞G1期的持续时间，推动细胞周期进程。Norbury等[15]也研究发现cyclinE通过与CDK2结合成复合体促进处于G1期的细胞向 S 期移行，cyclinE的表达越高其作用也越大。但是，本研究发现木薯淀粉组羔羊瘤胃上皮cyclinD1的mRNA表达量显著较低，这与瘤胃上皮形态结果不相符，所以需要我们进一步在蛋白水平进行验证。同时，本研究发现，木薯淀粉开食料组羔羊瘤胃上皮cyclinA的mRNA表达量较高。研究表明，cyclinA在S阶段和G2/M阶段发挥重要作用[16]，cyclinA-CDK2复合物使关键DNA复制因子磷酸化驱动染色体的复制[17]。Girard等[18]也提出，cyclinA在控制哺乳动物细胞的DNA复制中起主要作用。以上研究结果显示，木薯淀粉通过促进羔羊瘤胃上皮细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的表达，推动了细胞周期循环，进而促进了羔羊瘤胃上皮发育。

3.3 断奶前补饲不同直/支链淀粉比开食料对羔羊瘤胃上皮细胞IGF-1和IGF-1R的mRNA表达量的影响

研究表明，细胞周期蛋白的表达受较多因素的影响，例如：IGF-1，上皮调节因子等。IGF-1作为有丝分裂原刺激剂，在和受体结合后可以激活下游信号通路，促进哺乳动物细胞增殖以及机体、器官、组织的生长发育。Lu等[19]体外研究发现，IGF-1可促进瘤胃上皮细胞cyclins的表达。Shen等[20]研究发现，山羊饲喂高能量饲料可以刺激瘤胃上皮IGF-1的表达，进而刺激瘤胃上皮的发育。本研究发现，木薯淀粉开食料组羔羊瘤胃上皮IGF-1及IGF-1R的mRNA表达量显著升高。这可能是由于木薯淀粉在瘤胃中降解率较高，产生的能量较高，刺激了瘤胃上皮IGF-1的表达。所以，木薯淀粉开食料可能是通过IGF-1信号途径，加速了细胞周期进程，进而促进了羔羊瘤胃上皮的发育。

4 结论

含有较高支链淀粉(木薯淀粉)开食料在瘤胃中较易发酵生成VFA，促进了瘤胃上皮IGF-1及细胞周期蛋白mRNA的表达，增加了断奶前羔羊瘤胃乳头的长度、宽度和表面积。研究结果为制订羔羊营养方案具有重要指导意义。