机械应力对C57BL/6小鼠成骨细胞分化和凋亡的影响

陈熙 郭健民 邹军

1温州医科大学体育科学学院（温州 325035）

2上海体育学院运动科学学院（上海 200438）

3上海体育学院发展规划处（上海 200438）

在人体内，成骨细胞的骨生成作用和破骨细胞骨吸收作用共同作用于骨量的动态平衡，维持骨健康。运动可以促进骨生成，保持该动态平衡维持在较高的骨量水平；对其机理的研究发现，单纯的机械应力刺激是其重要的调节因素[1]。相反，骨骼长期处于低应力的状态下则会造成骨量的丢失，并伴随着骨强度的降低，严重的甚至会发生骨质疏松症及应力性骨折等，如宇航员在失重的环境下生活，每月髋部的骨量丢失甚至达到了2%[2]。在体动物和离体细胞水平的研究均指出，各种机械应力包括牵张力、流体剪切力、压应力等可以对体内骨组织细胞如间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）、成骨细胞、骨细胞产生刺激，促进成骨增殖和分化[3-5]。但是机械应力的参数如强度、频率和刺激时间对细胞分化作用的影响较大，即适宜的应力刺激可以促进向成骨方向分化，强度和时间过大或过低均不利于成骨分化，甚至还会诱导细胞凋亡[6-8]。同时，机械应力促成骨分化还具有细胞类型依赖性，不同的细胞类型具有不同的应力刺激的生理适应范围，对应力的耐受性也存在较大差异[9]。前期的研究主要采用肿瘤细胞系，对原代成骨细胞的研究相对较少，且机械应力对成骨细胞凋亡的影响也尚未研究清楚，为更进一步研究牵张应力对成骨细胞分化和凋亡的影响，本研究将采用国际上应用较多也较成熟的细胞应力加载系统——Flexcell-FX5000，对C57BL/6小鼠成骨细胞进行机械牵张应力的干预，观察不同强度和时间的牵张应力对成骨细胞分化和凋亡的影响，探讨促进成骨分化的适宜机械牵张应力。

1 材料与方法

1.1 仪器与主要试剂

Flexcell-FX5000细胞力学系统；细胞培养箱（Thermo，USA）；流式细胞仪（Beckman FC500,USA）；酶联免疫检测仪（BioTek，USA）；α-MEM（Hyclone，USA）；胎牛血清（FBS）（Gibco，10099-141）；0.25%胰酶、青霉素、链霉素、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（碧云天）；细胞凋亡试剂盒（Annexin V-FITC/PI，BD PharmingenTM）。

1.2 细胞提取和培养

新生C57BL/6小鼠6只，无菌条件下取出颅盖骨，D-Hanks液漂洗后剪成约0.5 mm×0.5 mm大小的骨碎块，用α-MEM培养液（含10%FBS+100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml链霉素）润洗后贴于细胞培养瓶底部，通过植块法培养原代成骨细胞。长满后用0.25%胰酶消化细胞，用α-MEM培养液，于5%CO2、37℃的培养箱中进行常规细胞培养，每3天换1次液，长至70%～80%融合的时候进行1∶3传代。传至第3代时，取一瓶细胞通过碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）染色和茜素红染色进行细胞鉴定（图1）。

图1 成骨细胞鉴定

1.3 施加牵张应力

取第3代生长良好的成骨细胞用于本实验，胰酶消化后重悬，调整细胞浓度至1×105/ml后接种于Bio-Flex®Plate6孔板（底部为弹性硅胶膜，适用于细胞牵张专用），加培养液常规培养2天，换诱导分化液（含抗坏血酸L、β-甘油磷酸钠）后对细胞进行牵张应力干预（Flexcell-FX5000，USA）。分别采用3%、6%、12%形变幅度的正弦波，0.5 Hz频率，对细胞进行2、4、8、12 h的牵张干预，对照组细胞在相同环境下正常培养，不进行干预。实验结束后即刻收集细胞。每组3个孔，实验重复3次以上。

1.4 ALP活性测定

实验结束后，用PBS洗涤成骨细胞3次。之后每孔加入0.2%TritonX-100 2 ml裂解细胞后置于4℃过夜制备样本，按照ALP试剂盒说明书对样本进行ALP活性测定，详见文献[10]。

1.5 细胞凋亡水平分析

对收集的细胞采用流式细胞仪检测其凋亡水平。用0.25%胰酶消化细胞，冰PBS洗涤3次，Binding Buffer缓冲液重悬细胞并调整至1×106/ml浓度，取100 μl细胞重悬液置流式管中，分别加入5 μl Annexin VFITC 和 5 μl PI，混匀后室温避光 15 min，加入 400 μl Binding Buffer缓冲液终止反应，上机检测。每个样本收集10000个细胞，采用仪器自带的软件CXP analysis进行分析，分别统计正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡细胞所占的比列。

1.6 统计学分析

所有数据以均数±标准差表示，首先采用双因素方差分析以明确牵张强度和时间因素对成骨分化和凋亡的影响作用，再采用单因素方差分析分别对同一强度下的时间因素进行分析，组间比较采用Bonferrori法。使用SPSS19.0统计软件包对数据进行统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞ALP活性

双因素方差分析显示，强度因素和时间因素对成骨细胞ALP活性均有显著性影响，且两者之间有交互作用。如图2所示，3%和6%强度的机械牵张应力干预可以显著提高成骨细胞ALP活性（P＜0.05），且6%强度干预后促进ALP活性的效果高于3%的强度。同时，在时间效应上，这两个强度干预均可使成骨细胞ALP活性先升高后降低，当干预4 h和8 h时，ALP活性增加的效应最大，其中6%强度连续干预4 h的效果最佳。12%强度应力干预2 h时成骨细胞ALP活性出现先升高（P＞0.05）后降低的趋势（连续干预12 h组P＜0.05，其余组别无统计学差异）。

图2 各组别成骨细胞不同时间牵张干预后的ALP活性（n=3）

2.2 成骨细胞凋亡率

双因素方差分析显示，强度因素和时间因素对成骨细胞的凋亡均有显著性影响，且两者之间有交互作用。如图3、4所示，进一步采用单因素方差分析发现，当对成骨细胞进行6%强度牵张干预时，细胞凋亡率（包括早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率）随着时间的延长出现先降后升的趋势，其中4 h干预时细胞凋亡率最低，12 h干预时凋亡率最高；3%和12%强度干预时，细胞凋亡率随着时间的延长先保持不变，后出现显著的上升趋势，其中3%在前4 h干预细胞凋亡率无显著性差异（P＞0.05），8 h和12 h干预后细胞早期凋亡率和总凋亡率出现显著升高（P＜0.05），12 h干预组还出现晚期凋亡率显著升高（P＜0.05）；而12%强度对成骨细胞进行牵张干预4 h后细胞凋亡率即出现显著升高（P＜0.05），之后随着时间的延长细胞晚期凋亡率和总凋亡率都出现持续上升趋势，而早期凋亡率则无显著性差异（P＞0.05）。

图3 各组细胞牵张干预后流式细胞代表图

图4 不同强度牵张刺激后成骨细胞的凋亡率（n=3）

3 讨论

沃尔夫定律指出，成骨细胞和破骨细胞的动态平衡受到机械应力的影响。适宜的机械应力则会促进机体骨形成，其作用主要是由应力通过细胞的力学感受器介导了一系列的信号转导通路，如Wnt、BMPs、MAPK、JNK等，激活BMSC向成骨分化、成骨细胞的分化以及增加骨细胞基质的分泌等促进骨生成[10-12]，同时抑制BMSC向成脂分化[13]。Guo等[14]研究发现，周期性牵张刺激不仅能增加BMSC的ALP、骨桥蛋白和I型胶原的表达，同时还抑制了破骨细胞系RAW264.7的分化，其机制可能是通过P38-MAPK信号转导通路促使BMSC向成骨分化。但不同的机械应力参数（包括强度、时间、频率、波形等）对成骨细胞分化作用的差异较大，甚至还会起负面作用。故本研究采用国际上广泛应用的细胞应力加载系统——Flexcell-FX5000[10-13]，对成骨细胞进行周期性牵张应力加载，观察不同强度和时间机械牵张应力刺激后成骨细胞的凋亡水平。

成骨细胞分化的过程中，ALP分泌量逐渐增多，因此ALP活性可以作为成骨细胞早期分化的标志。本研究对C57BL/6小鼠的成骨细胞进行不同强度和时间的牵张应力刺激，结果发现中（6%）、低（3%）强度的牵张应力刺激可以显著增加成骨细胞ALP活性，促进成骨分化，且中等强度刺激在效应量上要高于低强度刺激，这与本研究团队前期对MC3T3-E1细胞的研究结果一致[10]，提示在一定的强度范围内，牵张应力促成骨分化的作用随着强度的增加而增加。虽然有研究报告，高强度的牵张应力也可以促进成骨分化，如Tang等[15]对MC3T3细胞进行牵张刺激，随着牵张幅度的提升，细胞OPG的表达越来越多，而RANKL的表达则越来越少；李菲菲等[16]对Sao-2细胞进行12%的牵张刺激后发现其可以增加ALP的活性，促进成骨分化。但也有研究显示，高强度牵张刺激会抑制成骨分化，如对ST2骨髓基质细胞、HOB成骨细胞系的研究均发现，高强度（＞10%）牵张刺激抑制细胞ALP活性和钙化结节的形成[8,9,17]。本研究结果显示，高强度（12%）牵张刺激后，C57BL/6小鼠成骨细胞的ALP活性出现下降趋势，分析可能是高强度牵张过程容易对细胞造成机械损伤，不利于成骨细胞的分化，而不同的细胞系对牵张强度的耐受性不同[9]，这也可能是本研究结果与Tang等和李菲菲等的研究结果不同的原因，提示牵张应力促成骨细胞分化还具有细胞类型依赖性，不同的细胞类型具有不同的应力刺激的生理适应范围。

在时间效应上，本研究结果显示，在6%强度下牵张4 h，成骨细胞的ALP活性最高，刺激8 h和12 h则ALP活性开始下降，但仍高于对照组；而3%强度牵张刺激下ALP活性的最高值则延长至8 h，12 h牵张ALP活性开始下降，这些结果提示促进成骨细胞分化的牵张应力具有强度和时间依赖性。高强度牵张在促进细胞分化的同时，也会引起细胞凋亡。如12%强度的牵张刺激激活了成骨细胞caspase-3和caspase-8的表达，增加了细胞凋亡率[18]；HOBs细胞系在10%强度牵张刺激下细胞的成活率下降，MMP-8/MMP-1的比值升高[19]；高强度的牵张和压应力刺激会使细胞白介素-6（IL-6）、环氧化酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP3和MMP-8的表达升高，诱发细胞凋亡[20,21]。因此我们对应力刺激后成骨细胞的凋亡状况进行检测。结果发现，12%强度牵张刺激下成骨细胞凋亡率在2 h后随着时间的延长出现持续上升的趋势，与以上研究结果一致，这也解释了高强度牵张应力刺激下细胞的ALP活性甚至出现下降的原因。而在6%强度刺激下，细胞凋亡水平则出现先降低后上升的趋势，其中4 h是临界点，超过4 h的牵张应力（8 h、12 h）则使细胞的凋亡率上升，该结果也与ALP活性在8 h和12 h相较于4 h下降一致。同时，长时间牵张刺激下（12 h）三个强度（3%、6%和12%）均表现出细胞凋亡水平上升的趋势，与强度关系不大，提示牵张应力刺激下成骨细胞凋亡的趋势也具有强度和时间依赖性。另外，12%强度刺激主要是引起晚期凋亡率的增加，而3%强度刺激时是先引起早期凋亡的增加，后引起晚期凋亡的增加。这也提示了高强度的牵张更容易造成细胞凋亡至死亡，而低强度牵张刺激则需要长时间刺激才会对细胞造成机械损伤至死亡。

综上所述，机械牵张应力可以促进C57BL/C小鼠成骨细胞分化，以6%强度的牵张干预4～8 h为宜。同时，牵张应力还会影响成骨细胞的凋亡，6%强度牵张4 h细胞的凋亡率最低，增大牵张强度或者延长干预时间均会导致细胞的凋亡率增加。虽然细胞实验的结果与在体动物有较大的差异，结果较难直接指导运动防治骨质疏松中的强度和时间控制，但本研究的结果在细胞水平层面上验证运动强度和时间的适宜性对于刺激成骨分化，减少凋亡具有重要的作用。