晚期结直肠癌肿瘤的循环细胞检测及临床意义

雷 蕾 叶 斌

（成都市第六人民医院肿瘤科，四川 成都 610051）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，我国的发病率和病死率呈逐年升高的趋势，有20%～45%的患者在术后3年内复发或发生远处转移[1]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指实体瘤患者外周血存在的肿瘤细胞，是恶性肿瘤转移的必要条件。检测CTC有助于判断患者发生远处转移的风险及预后，指导治疗手段的选择[2]。本研究检测2015年6月至2017年2月晚期结直肠癌患者45例，同期入组体检健康人45例作为对照组，具体分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2015年6月至2017年2月晚期结直肠癌患者45例，同期体检健康人45例，分为观察组；男26例，女19例，年龄54～79岁，平均（66.2±11.5）岁，对照组：男22例，女23例，年龄52～78岁，平均（67.1±10.8）岁。

1.2 方法

1.2.1 血样采集：采集7.5 mL的肿瘤患者外周静脉血，肝素抗凝。

1.2.2 肿瘤细胞的富集：用PBS按1∶1的比例等倍稀释全血，转移至离心管定容至50 mL，室温800 g离心15 min，弃上清，轻吸出单核层细胞转移至新的50 mL离心管，加入20 mLPBS混匀，4 ℃ 300 g离心15 min后去上清ā加入200 μL PBS溶液重悬细胞，转移至1.5 mL离心管，将捕获抗体（Ep CAM）混入，在18～20 ℃下孵育1 h后，加入800 μL PBS混匀，300 g离心5 min，洗涤2次，弃上清液，加入200 μL PBS重悬细胞ā取滤液，泵入修饰过的芯片以流速200 μL/h进行细胞分离，1 h后拆下芯片置于平皿进行检测。

1.2.3 CTC的免疫染色鉴定：芯片室温干燥，加入2%多聚甲醛固定15 min后去除固定剂，加入透膜剂，处理15 min后加入一抗混合液（CK，CD45），于4 ℃避光过夜孵育。次日用7～8 mL PBS分三次泡洗，混入二抗混合液（Alexa488 和Alexa 555），室温避光孵育40 min后加入，染核试剂（DAPI）20 min。再次用PBS泡洗3次，室温晾干后镜下观察。

1.2.4 CTC阳性判断标准：CK＋（Alexa488）/CD45-（Alexa555）/nuclear＋（hochest33342）的细胞判断为循环肿瘤细胞。

1.3 统计学处理：采用SPSS17.0软件对数据进行处理，计量资料用（-x±s）表示，计数资料比较进行χ2检验，两组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌及对照组循环肿瘤细胞的检测结果：对照组均未查到CTC（-），检出率为0%（0/45），观察组检测出CTC21例，占46.7%（21/45），两组患者的CTC检测阳性率相差显著（P＜0.05），见表1。

表1 CTC的表达情况与患者临床特征的关系

2.2 化后对CTC阳性率的影响：化疗前后CTC阳性率具有显著统计学差异（P＜0.05），见表2。

表2 化疗前后患者CTC阳性率比较

3 讨 论

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）指从原发灶或转移灶脱落下来的细胞[3]，通过血管或淋巴系统进入血液，形成微小癌栓，最后发展为转移灶[4]。CTC操作简便，标本易得，具有肿瘤的特征。多项研究表明 CTCs 的数量与 CRC 患者的预后关系密切[5]。Rahhari等[6]的Meta分析结果显示CTC不受年龄ā性别ā肿瘤病灶的分化程度等因素的影响，但与患者病理分期相关，可以作为患者预后和临床评价的标志物。

肿瘤患者的治疗一般由肿瘤的分期、病理分化及预后等因素来决定，但目前评估疗效评价的手段有限，不能及时发现肿瘤的早期转移。Ⅱ期临床研究表明，术后或化疗前CTC的检出是乳腺癌患者早期复发的独立预测指标[7]。治疗前后CTC数目的变化可以提示治疗效果的反应。ARBAZAN等用组合生物标记鉴定mCRC的CTC，发现患者治疗过程中CTC较CT更早出现变化，预后也较差。研究表明，CTC分子标记可以检测耐药基因的表达，有助于判断肿瘤患者疾病发展，评估和监测治疗效果，指导调整用药。本研究中，化疗观察组CTC阳性率显著降低（P＜0.05），与疗效存在负相关性，与之前报道结果一致。在治疗阶段，动态评估 CTCs 可以指导临床治疗方案的改进，减少不必要的药物毒性，给低风险的患者合理安排治疗间歇。

综上，检测CTC的数目变化可提示患者体内肿瘤细胞的变化趋势，是患者预后的独立预测因素，也可以作为检测治疗方案是否有效的重要指标。建立标准化的检测方案和评价标准仍有待于后续大规模临床研究。因此动态检测患者治疗前后CTCs的变化，可以作为一种新型诊断工具，具有重要的临床意义。