铵态氮和硝态氮调节盐胁迫豌豆幼苗生长和根系呼吸的作用

耿 杰，张琳捷，岳小红，曹 靖*，代立兰，蔡 锐，唐让云

（1 兰州大学生命科学学院/草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州 730000；2 兰州市农业科技研究推广中心，甘肃兰州 730000）

在干旱半干旱灌溉区土壤盐渍化的形成与发生是制约农业可持续发展的环境问题之一[1]。目前，全球至少有20%的灌溉农田遭受盐渍化或高盐水灌溉的威胁，而盐渍化土地面积仍在不断扩大，盐渍化程度也在不断加剧[2]。一些研究表明，外加腐胺[3]和Ca2+[4]等物质可以缓解盐分对植物的胁迫，陈昀等[5]以hemin为基础物质联用的方法缓解了大豆萌发过程中受到的盐胁迫。氮素是植物生长发育所需的大量营养元素之一，如果选择氮源作为调节剂，不仅能为植物生长提供营养物质，还能缓解盐胁迫对植物的危害，提高植物的耐盐性[6]。

盐胁迫主要增加了植物体内Na+和Cl–的积累，进而对植物产生毒害作用[7]。氮作为植物生长发育所必需的大量元素之一，适当控制氮水平可缓解盐胁迫对植物的毒害作用，增强植物的耐盐性[8–10]。有研究表明，在盐胁迫下外加中等浓度的NH4NO3可促进碱蓬的生长[10]，在0.4 mol/L盐胁迫下外加Mg(NO3)2和Ca(NO3)2，碱蓬的株高、地上及地下干重比同等盐胁迫下不施加的处理明显增加[8]；在低NaCl浓度胁迫下，外加适当浓度的氮素均能明显增强芦荟的生长，但当NaCl浓度过高则会抑制植物生长[11]，这说明在一定盐浓度下外加适量的氮素会缓解盐胁迫对植物的危害。

根系是盐胁迫对植物危害最直接、最敏感的部位[12]，植物根系对周围环境的敏感性与适应性决定着植物感知与响应盐、水等任何胁迫的能力[13]。植物根系呼吸不但为植物的生长发育提供其所需的能量，还通过消耗植物光合作用合成的碳水化合物促进整株植物的代谢活动。对番茄的研究表明，NaCl浓度达到120 mmol/L时，根系呼吸速率和细胞色素呼吸速率都明显下降[14]。氮的消化吸收可能会影响植物的碳水化合物和能量代谢，进而影响植物的根系呼吸，但目前国内外对根系呼吸的研究仅集中于单纯的氮源或其他胁迫因素的影响[15–16]，而在盐分胁迫条件下，添加不同形态氮源对根系呼吸的影响却鲜有报道。本文以3个豌豆品种为试验材料，通过砂培试验研究两种氮源调节豆科植物盐胁迫的生理生态机制，尤其是对根系呼吸的影响，探明豆科植物根际激发效应受非生物因素影响的发生机制，为采取合理的调控措施缓解豆科植物的盐分胁迫提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试豌豆品种分别为银碗1号 (甘肃省白银市农科所提供)、S5001-1 和 Ha (甘肃省农科院提供)，2012—2013年间，3个豌豆品种在甘肃省永登县盐渍化农田试验的产量结果分别为4095、4715和5096 kg/hm2。

1.2 试验处理

试验在人工气候室中进行，人工气候室条件：昼/夜温度为28℃/23℃，湿度为70%，光周期为14 h，光强为 400～450 μmol/(m2·s)。豌豆种子萌发露白后移栽到直径为5 cm、高为20 cm的PVC管进行培养，管内装石英砂和蛭石混合物 (石英砂∶蛭石=2∶1)，每个PVC管种6株幼苗，移栽后第一次浇1/4 Hoagland营养液60 mL，之后每两天浇一次1/4 Hoagland营养液30 mL至第12天，出苗一周后进行间苗，保留4株长势一致的幼苗。幼苗生长12天改用1/2 Hoagland营养液，其中添加氮源分别为铵态氮 (4 mmol/L) 和硝态氮 (4 mmol/L)，NaCl浓度设3个梯度，分别为0、50和100 mmol/L，每个品种共6个处理[17]，每处理重复3次，其中NaCl处理以每天25 mmol/L的速度递增，直至达到目标浓度。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 植株根系呼吸的测定 幼苗生长到 16 天时，将PVC管顶部用硅胶密封，用真空泵和硅胶管将种植植物的PVC管和试剂瓶等连接成一个循环系统，完全密封并检测气密性，除去气球及整个循环系统中的CO2后再进行收集，整个收集装置和收集过程及计算方法参考Cheng等[18]的研究。收集CO2所用碱液为 100 mL 0.5 mol/L NaOH，每次收集 6 h，收集结束后，取 10 mL NaOH，用 0.05 mol/L 的 HCl滴定。

1.3.2 植株生长指标的测定 植物收获后，将植株地上和根系分开，将根系用去离子水冲洗干净，吸干表面水分后用EPSON 4990扫描仪进行扫描，用Scion Image软件分析根长、根表面积等根系形态学参数；将地上和根系鲜样放入105℃烘箱中杀青30 min，70℃烘干至恒重，记录干重。样品研磨成粉末后用H2SO4–H2O2消煮，原子分光光度计测定Na+含量；Cl–含量用 AgNO3滴定法测定。

1.4 数据处理

用SPSS 17.0进行统计分析，LSD法进行多重比较 (P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同处理对豌豆幼苗地上生物量、根冠比和含水量的影响

由表1可见，同一豌豆品种地上部生物量在不同处理间差异显著。 3个豌豆品种均在100 mmol/L NaCl处理组下的生物量最小。无论是硝态氮还是铵态氮添加，银碗1号和Ha品种的生物量在50 mmol/L NaCl处理下均高于相应的对照处理 (CK)，而S5001-1的生物量则是CK组最大；在50 mmol/L NaCl胁迫下，3个豌豆品种在添加硝态氮处理的生物量明显高于添加铵态氮。同一豌豆品种的根冠比在不同处理下表现不同，银碗1号和S5001-1的根冠比均在50 mmol/L NaCl胁迫下最高，S5001-1表现出添加硝态氮处理的根冠比显著高于添加铵态氮，而Ha在所有处理下差异不显著。 3个豌豆品种地上部含水量在50 mmol/L NaCl条件下，无论添加哪种氮源，与对照组相比均无差异，但在100 mmol/L NaCl胁迫下明显降低，并且添加硝态氮处理的地上含水量明显低于添加铵态氮处理。以上结果表明在中度盐浓度 (50 mmol/L NaCl) 条件下，添加氮肥有助于缓解盐胁迫对豌豆幼苗的毒害，且硝态氮缓解能力高于铵态氮。

豌豆品种间在同一处理下各指标差异情况有所不同，Ha品种的地上部生物量在同一处理下总体表现出高于其他两个品种的趋势，且显著高于S5001-1；而S5001-1根冠比在同一处理下显著高于他两个品种，银碗1号的相对较低；地上部含水量则表现出银碗1号的显著高于其他两个品种。

2.2 不同处理对根系形态的影响

由表2可见，除品种Ha的根干重外，同一豌豆品种的根干重、根长和根面积在不同处理组间差异显著。与CK相比，50 mmol/L NaCl处理均增加了3种豌豆的根重、根长和根表面积，并且添加硝态氮处理明显高于添加铵态氮处理。银豌1号和S5001-1在50 mmol/L NaCl和铵态氮处理下，根干重、根长和根表面积均显著高于其他处理；而对品种Ha来说，仅根长和根表面积在50 mmol/L NaCl和硝态氮处理下明显高于其他处理，而根干重在不同处理间没有差异。100 mmol/L NaCl胁迫下，添加硝态氮处理下3种不同豌豆品种的根系生长要优于添加铵态氮。中度盐胁迫 (50 mmol/L NaCl) 促进了3种不同豌豆品种的根系生长，且同一盐浓度条件下，硝态氮缓解盐胁迫能力强于铵态氮。

3个不同豌豆品种的根干重、根长和根表面积在同一处理间差异显著 (P＜0.05)，均表现出 S5001-1 ＞Ha ＞ 银豌1号的变化趋势。

2.3 不同处理对豌豆幼苗根系呼吸速率的影响

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图1 盐胁迫下不同氮源对豌豆幼苗根系呼吸速率的影响Fig.1 Effects of nitrogen sources on root respiration rates of pea seedlings under salt stress[注（Note）：CK-NH4+—铵态氮对照 Control applied with NH4+; CK-NO3–—硝态氮对照 Control applied with NO3–; 50-NH4+—50 mmol/L NaCl +铵态氮处理 50 mmol/L NaCl + NH4+; 50-NO3–—50 mmol/L NaCl + 硝态氮处理 50 mmol/L NaCl + NO3–; 100-NH4+—100 mmol/L NaCl + 铵态氮处理 100 mmol/L NaCl + NH4+; 100-NO3–—100 mmol/L NaCl + 硝态氮处理 100 mmol/L NaCl + NO3–.]

由图1可见，3个不同豌豆品种的根系呼吸速率总体均随着盐分浓度的增加和培养时间的延长呈波动下降的趋势。对银豌1号，不同时期的根系呼吸速率在同一盐分水平下均表现为铵态氮添加处理高于硝态氮添加处理，呈现对照组 ＞ 50 mmol/L NaCl处理组 ＞ 100 mmol/L NaCl处理组的顺序；S5001-1豌豆品种随着盐分浓度的增加和培养时间的延长根系呼吸速率波动下降的幅度较小，而品种Ha根系呼吸速率波动下降的幅度较大，不同培养时间在同一盐分水平下均表现为硝态氮添加处理的根系呼吸速率高于铵态氮添加处理。

不同豌豆品种根系呼吸的累积量对氮源的响应不同 (表3)。无NaCl胁迫下，银豌1号和S5001-1根系呼吸累积量在铵态氮添加的处理明显高于硝态氮添加的处理，而品种Ha则相反；在50 mmol/L NaCl胁迫下，硝态氮添加刺激了S5001-1根系呼吸累积量，其与Ha在铵态氮添加的处理明显低于硝态氮添加的处理，而银豌1号则相反；在100 mmol/L NaCl胁迫下，仅Ha根系呼吸累积量在硝态氮添加的处理显著高于铵态氮添加的处理，而其他两个品种在不同氮源处理间没有显著差异。不同品种间，在铵态氮添加下银碗1号的根系呼吸累积量明显高于品种S5001-1和Ha，而在硝态氮添加下则是Ha的根系呼吸累积量最高。

2.4 不同处理对豌豆幼苗 Na+ 和 Cl– 含量的影响

3个豌豆品种幼苗地上部Na+含量均随着NaCl浓度的增加而增加 (图2)。在CK组和100 mmol/L NaCl处理下，两种氮源分别添加时，对银豌1号幼苗地上部Na+含量影响不显著，在50 mmol/L NaCl胁迫下，地上部Na+含量在添加铵态氮比添加硝态氮高43.51%；对品种S5001-1和Ha而言，在CK和50 mmol/L NaCl处理组地上部 Na+含量在不同氮源间没有显著差异，但在100 mmol/L NaCl胁迫下，铵态氮添加处理地上部Na+含量明显高于硝态氮添加。

表3 盐胁迫下添加硝态氮和铵态氮对豌豆根系呼吸的累积量的影响 (mg/plant)Table3 Cumulative root respiration of pea seedlings supplied with NH4+ and NO3– under salt stress

图2 盐胁迫下氮源对豌豆幼苗地上部分Na+和Cl–含量的影响Fig.2 Effects of nitrogen sources on Na+ and Cl– contents in shoot of pea seedlings under salt stress[注（Note）：CK-NH4+—铵态氮对照 Control applied with NH4+; CK-NO3–—硝态氮对照 Control applied with NO3–; 50-NH4+—50 mmol/L NaCl +铵态氮处理 50 mmol/L NaCl + NH4+; 50-NO3–—50 mmol/L NaCl + 硝态氮处理 50 mmol/L NaCl + NO3–; 100-NH4+—100 mmol/L NaCl + 铵态氮处理 100 mmol/L NaCl + NH4+; 100-NO3–—100 mmol/L NaCl + 硝态氮处理 100 mmol/L NaCl + NO3–.柱上不同小写字母、大写字母分别表示处理间、品种间差异显著 (P＜0.05) Different lowercase and capital letters above the bars indicate significant differences among treatments and among cultivars at P＜0.05 level.]

随NaCl浓度的增加，豌豆幼苗地上部Cl–含量也表现出增加的趋势 (图2)。同等盐浓度水平下，银豌1号幼苗地上部Cl–含量在两种氮源处理间差异不显著；而 S5001-1 在 50 mmol/L NaCl和 100 mmol/L NaCl处理组，添加硝态氮处理幼苗Cl–含量较添加铵态氮的分别提高37.08%和9.85%，表明添加硝态氮促进了 Cl–的吸收；对于 Ha来说，地上部 Cl–含量仅在100 mmol/L NaCl胁迫下添加硝态氮处理比添加铵态氮处理高出9.72%，而CK和50 mmol/L NaCl条件下，不同氮源处理间无显著差异。

3 讨论

3.1 氮源对盐胁迫下豌豆幼苗生物量的调节作用

有研究显示，在盐碱地上施加氮肥除了能够提供植物所需氮素营养外，还能提高植物的抗盐能力[11]，缓解盐胁迫对植物的毒害作用[9]，因为氮素能够增加原生质体的水合度，增强原生质的保水能力，进而能使盐胁迫对植物的渗透胁迫得到缓解。本试验中50 mmol/L NaCl条件下，添加氮源处理后，3个豌豆品种的地上和地下生物量较对照和100 mmol/L NaCl均明显增加，但在 100 mmol/L NaCl胁迫下，不论用哪种氮源调节豌豆幼苗地上部生长均受到抑制；相同氮源调节下，3个豌豆品种的地上生物量的大小呈 50 mmol/L NaCl处理 ＞ CK ＞ 100 mmol/L NaCl处理的变化趋势，这和Chen等[19]的研究结果相同，他们发现在中度盐浓度条件下，外加氮肥可促进植物对氮的吸收，减少对Cl–的吸收，而在重度盐分条件下，盐分成为限制植物生长和氮素吸收的主导因子，因此，外加氮源的调节作用变弱。铵态氮和硝态氮是植物吸收的主要氮形态，一般植物吸收硝态氮所消耗的能量要高于铵态氮，且铵态氮相比硝态氮更有利于植物的生长和生物量的提高[20]；但砂培介质中微生物结构较土培试验简单，氮源供应方式更为直接，植物对氮形态的喜好不同[21–22]。本试验中，3个豌豆品种幼苗地上和地下生物量在50 mmol/L NaCl胁迫下硝态氮添加处理均高于铵态氮添加；在100 mmol/L NaCl胁迫下，银豌1号地上和地下生物量在硝态氮处理较铵态氮处理分别提高8.86%和15.79%，S5001-1的分别提高4.69%和10.71%，说明在NaCl胁迫下，硝态氮的缓解作用更大，可能原因是相对于铵态氮来说，硝态氮更有利于促进K+和Ca2+的吸收和向上运输，从而维持地上部较高的K+/Na+和Ca2+/Na+，维持幼苗体内矿质营养元素含量平衡，增强幼苗对盐胁迫的抗性[23]。

3.2 氮源对盐胁迫下豌豆幼苗根系呼吸的调节作用

植物响应盐胁迫危害最直接和最敏感的部位是根系。植物根系呼吸包括根组织呼吸和根际微生物呼吸[25]，土培试验产生的CO2除了植物根系呼吸还涉及到土壤微生物呼吸和微生物降解土壤有机质所产生的CO2[26]，而砂培介质则避免了土壤呼吸产生的影响，从而更有利于探讨植物的根系呼吸。根系呼吸进行顺利与否是衡量植物根系功能和逆境胁迫的重要指标之一[26]，在盐胁迫下植物根系呼吸速率的变化趋势因盐分浓度和物种而异。土培试验结果显示，较低浓度或中等浓度 (0.5%) 的盐胁迫会刺激植物的根系呼吸，而较高浓度的盐胁迫 (1.5%) 则明显降低了根系呼吸[23]，这和本试验结果类似，3个豌豆品种在100 mmol/L NaCl处理下根系呼吸速率明显受到抑制，对S5001-1来说，根系呼吸速率在50 mmol/L NaCl条件下要高于对照，一方面可能是因为适当盐度刺激了S5001-1根系生长，其根重、根长和根表面积较对照均明显增加，根系繁殖促进了根系呼吸加强[27]；另一方面，中等盐浓度胁迫下细胞内的ATPase活性提高，维持跨膜质子梯度和胞内离子平衡，使根系呼吸处于较高状态[28]；另外，植物根系在盐胁迫下会产生分泌物，而豆科植物根分泌物中含氮量较多[29]，产生正根际激发效应，增加了根际CO2的量。对银碗1号和Ha，在50 mmol/L NaCl处理下虽然促进了根系生长，但根系呼吸速率却低于对照组，可能原因是比根长和根序的增加，盐分胁迫促进了总的非结构碳水化合物的浓度，从而降低了根系呼吸[30]。

植物的根系呼吸与其含氮量有着密切的关系[31]。不同形态的氮源对根系的影响不同，有研究表明施加铵态氮时豌豆对盐胁迫更敏感[32]，而有些研究认为施加硝态氮时豌豆对盐胁迫更敏感，并且在盐胁迫下施加硝态氮更有利于植物的生长[33]。本实验中，银豌1号的根系呼吸速率表现为添加铵态氮处理要高于添加硝态氮处理，大小顺序为 CK ＞ 50 mmol/L NaCl ＞100 mmol/L NaCl，该结果与 Lasa 等[34]的研究一致，

即铵态氮有利于植物的根系呼吸，可能原因是：植物吸收同化铵态氮所需能量远低于硝态氮，且吸收同化铵态氮的位置一般在植物根系中，运输到根系的碳水化合物大部分用于植物根系呼吸，而植物对硝态氮吸收则需要两步转化才能被利用，该过程是个耗能过程，并且大部分硝态氮需要运输到茎和叶片中才能被植物吸收同化，所以相同条件下只有一部分碳水化合物用于植物的根系呼吸[34–35]；另外，还有学者认为铵态氮促进了交替途径的活性，加速了呼吸过程[34]；而对S5001-1来说，在硝态氮添加下，50 mmol/L NaCl刺激了其根系呼吸，较对照根系呼吸累积量增加19.64%，该结果与王树凤等[36]的研究一致，说明适当的盐分胁迫会刺激豌豆的根系呼吸，可能是交替呼吸电子传递途径发生改变，导致交替呼吸时间延长，呼吸速率呈上升趋势；而品种Ha的根系呼吸速率则与银豌1号相反，但与Gavrichkova等[37]的研究结果一致，这主要取决于植物本身的生理学特征，根系会减少硝酸盐含量，增加碳水化合物的量，并以CO2的形式释放出来。3个豌豆品种在不同氮源条件下呼吸速率表现不同，这说明氮源调节盐胁迫植物根系呼吸的作用因物种的不同而异。

3.3 氮源对盐胁迫下豌豆幼苗Na+和Cl–含量的影响

植物为提高自身的耐盐性会在体内形成盐分离子区隔，从而维持体内的离子平衡[38]。对于大多数植物而言，Na+在植物体内过度累积会造成毒害，改变细胞的功能状态，导致生理胁迫[39]。本研究中3个不同豌豆品种地上部Na+和Cl–含量随着盐分浓度的增加而呈增加趋势，尤其是Na+含量 增加幅度最大，且盐分处理间差异显著 (P＜0.05)；3个豌豆品种幼苗中，品种Ha的地上部分Na+含量最高，品种S5001-1幼苗地上部Cl–含量最高。盐胁迫下，外加氮源会影响植物对离子的选择性吸收[40]，从而使Na+和Cl–主要积累在成熟的叶片和茎秆中，间接缓解了NaCl胁迫对嫩叶的危害。Barhoumi等[41]的研究中，100 mmol/L NaCl胁迫下，施加硝态氮会抑制短柄草体内Na+和Cl–的累积；本试验中，同一盐分胁迫下，银碗1号和S5001-1在添加铵态氮处理下幼苗地上部Na+含量要高于添加硝态氮处理，可能的原因是施加硝酸盐影响了植物生理生化代谢所需关键酶的活性，从而抑制了植物对Na+和Cl–的吸收与积累等[9,11]；对Cl–而言，在同一盐分胁迫下，银碗1号幼苗地上部Cl–含量在添加铵态氮处理下高于添加硝态氮处理，但S5001-1和Ha却恰恰相反，这可能和植物本身对离子的选择性吸收有关。

4 结论

中度盐 (50 mmol/L NaCl) 胁迫下，施加氮肥后增加了3个豌豆品种的生物量，说明外加氮肥可以缓解盐分胁迫，且硝态氮缓解能力高于铵态氮，但在重度盐分条件下盐胁迫是影响植物生长和离子吸收的主导因子，外加氮源调节作用变弱。本研究中，银豌1号在50 mmol/L NaCl胁迫下施加铵态氮的根系呼吸要高于硝态氮，品种Ha与银豌1号则相反，而品种S5001-1在不同氮源处理间差异不大，说明在中度盐胁迫下外加氮肥可增强根系呼吸，但不同豌豆品种的根系呼吸强弱受氮源种类的影响较大。在一定浓度盐分胁迫下，施加氮肥促进了豌豆幼苗对Na+和Cl–的吸收，减轻了盐分胁迫对根系的伤害。总之，在低度至中度盐浓度胁迫下，铵态氮和硝态氮具有调节盐胁迫豌豆幼苗生长和根系呼吸的作用，且硝态氮添加调节能力高于铵态氮；不同盐分浓度胁迫下，不同豌豆品种的根系呼吸对NH4+-N与NO3–-N的响应机制表现不同。