尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒分型定量结果分析及临床意义

梁娇 温淑娟 蔡贞

1东莞市第八人民医院检验科（广东东莞 523325）；2南方医科大学南方医院检验科（广州 510515）

尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）是由人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染引起的常见性传播疾病，好发于外生殖器和肛周等部位，患者患处可出现瘙痒、出血、压痛、灼热等症状，近些年来CA发病率明显上升，并可能引起癌变，引起人们的重视［1⁃4］。CA 在临床治疗方法很多，以去除疣体为主，但目前没有完全避免复发的疗法，有研究提示，治疗后参与皮损中仍含有HPV病毒，以及原发损害周围亚临床感染蔓延，是CA频繁复发的主要原因之一［5］，因此观察病损及周围部位HPV感染的变化可为疗效评判及随访提供一个客观的指标。目前国内临床上进行HPV DNA检测的主要方法有实时荧光聚合酶链反应（PCR）法、反向点杂交法、杂交捕获法。其中实时荧光PCR法具有高度特异性和灵敏性，通量高，操作简单等优势，对HPV分型检测很有优势［6⁃7］。但由于取样时很难控制样本中采集的脱落细胞数目，阴性结果无法排除取样原因，且由于细胞数目不能确定也无法对病毒进行定量分析，故而上述方法大多为定性检测，其对治疗过程中疗效判断价值有限。本研究采用多重FQ⁃PCR法进行HPV分型定量检测，通过对126例CA患者HPV分型及病毒载量检测结果进行回顾性研究，分析了CA患者HPV不同亚型感染概况及治疗中病毒载量的变化以及该检测方法对临床的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取南方医院2015年12月至2016年9月皮肤性病科门诊尖锐湿疣患者126例，其中男68例，女58例。患者年龄1～75岁，平均30.3岁。所有患者根据中华人民共和国卫生行业标准WS 235⁃2003确诊，且经HPV检测为阳性，均告知相关事宜并签署知情同意书。发病部位以阴茎冠状沟、龟头、包皮系带、尿道口、阴道口、肛周多见。纳入感染型别统计的患者均为首次就诊检查结果，同一患者治疗期间复查结果未计入内。其中21例患者治疗后复查数据用于观察疗效与病毒载量的关系。

1.2 检测方法临床医师以样本刷于疑似病变部位采集样本后置于样本保存液中送检。HPV检测采用硕世生物科技有限公司人HPV核酸分型检测试剂盒。该试剂可检测21种HPV亚型，具体包括18种高危亚型（HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，26，82，73）及3种低危亚型（HPV 6，11和81）。提取样本DNA后，分别加入试剂反应管。每一样本使用1排PCR八连管，每一管检测以FAM、HEX、ROX标记的3个亚型。第8管为参考基因，用于监控并排除由于仪器故障、试剂因素、操作不当或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，并可指示样本取样细胞数目是否达标及作为定量计算参考。每次实验加入空白及阳性对照与检测样本同时运行。检测结果根据反应Ct值使用试剂配套分析软件进行病毒载量分析。

1.3 统计学方法数据分析采用SPSS 20.0软件进行分析。计量资料经对数处理后计算其均数及标准差，高、低危组病毒载量差异及感染率差异分别采用Mann⁃whitney和卡方检验计算P值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV分型定量检测结果概况分析126个样本中共检出20种基因型，包括17种高危亚型（其中HPV26型未检出）和3种低危亚型。CA感染以低危亚型为主，HPV6、HPV11、HPV81检出率分别为49.21%、30.95%和11.9%。分析病毒载量，低危型别组的病毒载量也明显高于高危型别组，但统计学分析显示两组差异无统计学意义（P=0.07）。见表1。

表1 126例CA患者HPV亚型感染概况Tab.1 An overview of HPV subtype in 126 patients with CA

此外，统计结果显示多重感染多见，占总感染例数37.3%，其中以二重感染多见（表2）。取感染例数多于6例的HPV亚型进行统计，发现高危型HPV常见多重感染（表3），与低危组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。如以年龄段划分，HPV感染率以21～30岁组（48.4%）以及31～40岁组（26.2%）较高。但＜20岁年龄组患者中，多重感染比率（61.5%）明显高于其他年龄组（表4）。

表2 126例患者HPV多重感染统计Tab.2 HPV multiple infection in 126 patients

表3 不同型别HPV多重感染占比情况Tab.3 HPV subtype proportion in multiple infection

表4 不同年龄阶段尖锐湿疣患者HPV检出概况Tab.4 HPV detection in patients with CA at different ages

2.2HPV分型定量用于监测CA治疗疗效126例患者中有21例患者接受了光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）并且在每次PDT后进行了HPV定量检测，有13例（62%）患者在PDT治疗后，HPV病毒量明显下降。4～9次PDT治疗后，患病部位检测不到HPV病毒，且1个月后复查病毒载量仍为0。其余患者病毒载量仅下降1～2个数量级，甚至无下降或上升。在其中随机挑选2例观察其具体数据，记录检测结果见表5、6。病例1为单一感染HPV11女性患者，使用PDT治疗3次，检测结果显示患者病情未见好转，甚至病毒量有上升趋势。病例2为青年男性患者，首次检测为HPV6感染，治疗后相隔近5个月后出现再发，检测为HPV52和HPV58型，说明为再次感染而非复发，治疗后病毒转阴。

表5 27岁女性患者HPV病毒载量变化Tab.5 Changes of viral load of a 27 years old female patient

表6 31岁男性患者HPV病毒载量变化Tab.6 Changes of viral load of a 31 years old male patient

3 讨论

本实验采用多重FQ⁃PCR进行HPV分型定量检测，在126例HPV感染CA患者中，低危型感染检出率占92.06%，以HPV6和HPV11型为主，与国内外文献一致［8⁃13］。低危型组HPV病毒载量高于高危型组。HPV6、HPV11和HPV81平均病毒载量分别为1.18×107和9.48×106和1.84×106；而高危型HPV病毒载量均值大多104或105，但统计学分析差异无统计学意义，可能因为部分型别例数偏低造成了偏差。CA患者年龄跨度较大，说明感染人群广泛，感染人群主要集中在21～40岁（74.6%），与这个年龄段处于性活跃阶段，有较高的感染概率相关［14］。多重感染比率在＜20岁组明显高于其他年龄组，且高危型HPV感染者有更高的多重感染比率（表3、4）。通常认为一种HPV型别感染并不造成对其他型别易感性增加，故而推测这些多种HPV亚型的感染是相互独立的，造成多重感染的原因可能是频繁更换性伴侣或免疫系统受损［15］。对于这一部分患者应积极治疗并定期复查，对于控制CA及预防癌变有积极意义［16］。

通过对治疗中连续检测病例的观察可以发现监测感染型别和病毒载量的变化对CA的疗效评判及观察疾病发展有重要指导意义。CA治疗方法以局部去除疣体为主，一般以肉眼判断皮损是否好转、原有疣体是否清除，或醋酸白试验作为疗效评判标准。但可能由于存在肉眼看不见的亚临床潜伏感染、或某些患病部位体格检查时无法发现等，导致治疗难以彻底，而肉眼无法观察致病病毒是否被彻底清除［5］。本研究采用的方法在HPV分型检测的同时，通过引入上皮细胞参考基因，一方面有助于排除实验环节或取样造成的假阴性；另一方面可作为基准计算出感染病毒的数量⁃即感染单位（感染单位定义为每10 000细胞的病毒感染量）。此外，出现多重感染时，还可计算出不同亚型占比（表6），获得优势感染亚型信息。本研究通过对21例在PDT治疗期间重复检测HPV病毒量病例的观察，发现同一患者不同时间点以及不同采集部位，检测结果型别很恒定，病毒载量变化与临床观察高度相符，这一结论也与HU等［17］的报道完全一致。本文随机选取的病例中，患者1多部位单一感染HPV11，治疗期间病毒载量无显著下降，甚至出现上升趋势。患者2最初感染HPV6，经治疗病毒转阴。2个月后再次就诊，出现新发感染HPV52和HPV58。以上两个病例均可以直观地明确治疗效果，判断复发趋势，而定性检测无法给出这样的临床信息，体现了分型定量检测对于临床治疗的重要指导意义。

综上所述，HPV分型定量检测对于CA的诊断和疗效监测有着明确的指导意义。本研究的缺陷在于纳入病例较少，且临床资料不够全面。对于探讨低危型与高危型HPV感染病毒载量的差异对CA症状及治疗的影响，以及病毒载量与治疗效果、治疗疗程间的关系还需要进一步进行追踪与探讨。