姜黄素微乳凝胶抗皮肤纤维化作用的实验研究

韩桂香 刘 嘉 朱萱萱 张 迪

（1.江苏卫生健康职业学院，江苏南京211800；2.南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

近年来，因明确的药理作用和较低的毒副作用，姜黄素（curcumin）及其相关制剂在皮肤疾病中有较为广泛的应用[1]。有研究认为，姜黄素具有清除活性氧自由基及抗脂质过氧化的作用，可防护人角质形成细胞的氧化损伤，还对瘢痕疙瘩成纤维细胞、人增生性瘢痕成纤维细胞具有明显的抑制作用，也具有明显的抗炎和抗皮肤微生物的作用[2]。尽管应用前景广泛，但由于姜黄素水溶性低，且在中性pH中不稳定，这样的理化性质限制了其进一步开发利用。姜黄素的外用制剂往往因释药缓慢，累积释药量达不到治疗浓度而影响治疗效果[3]。基于此，我们通过制剂学的方法改变姜黄素的理化性质，将姜黄素制备成新型的载体经皮给药系统——微乳凝胶，对比姜黄素普通凝胶与姜黄素微乳凝胶对小鼠皮肤纤维化模型的作用，并深入探讨其机制，以期为姜黄素进一步的开发及临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物 6周龄SPF级Balb/c小鼠，雄性，体重20～24g，由北京维通利华提供，动物合格证号：SCXK（苏）2016-0003。

1.2 试药 姜黄素（纯度95%，西安四季生物科技有限公司）；聚山梨酯-80（广州广醇化工科技有限公司）；辛酸癸酸甘油三酯（德国BASF）；乙基己基异壬酸酯（上海誉宇新材料科技有限公司）；油酸（汕头市西陇化工厂）；泊洛沙姆407（德国BASF）；无水乙醇（上海久亿化学试剂有限公司）；二甲苯、盐酸、氨水、中性树胶、30%H2O2，国药集团化学试剂有限公司；苏木素、伊红，武汉谷歌生物科技有限公司；积雪苷软膏（积雪总苷含量为0.025g/g，上海现代制药股份有限公司）；博来霉素（海正辉瑞制药有限公司）；羟脯氨酸测试盒（南京建成生物工程研究所）；Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）试剂盒，转化生长因子β（TGF-β）检测试剂盒，基质金属蛋白酶9（MMP-9）检测试剂盒，南京拜睿生物科技有限公司。

1.3 仪器 T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）；JJ-12J脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；JB-P5石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016石蜡超薄切片机（上海徕卡仪器有限公司）；Nikon DS-U3生物正置光学显微镜（日本尼康）；JB-L5冻台（武汉俊杰电子有限公司）；组织摊片KD-P机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；DNP-9022 37℃恒温培养箱、DHG-9108A鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 姜黄素微乳凝胶的制备 以伪三相图法筛选姜黄素微乳的工艺，微乳制备完成后再制备成凝胶剂。经过筛选，姜黄素微乳的最优处方为：水相为无水乙醇25%，水53.5%；油相为油酸和乙基己基异壬酸酯的混合物（1∶1）6.8%，表面活性剂为聚山梨酯-80与辛酸癸酸甘油三酯的混合物（1∶3）14.7%。制备方法：将适量姜黄素溶于无水乙醇，配置成10mg/mL的溶液，先后加入表面活性剂和油相，超声20min后，加入水相，缓慢加入，边加边搅，500r/min磁力搅拌45min即得姜黄素微乳。微乳制备完成后，以直接溶胀法制备微乳凝胶，将泊洛沙姆407置于微乳表面，放置4℃冰箱12h，待凝胶基质泊洛沙姆407溶胀后，缓慢搅拌，置室温下即得。姜黄素微乳凝胶含药量为2.5mg/mL。

2.2 姜黄素凝胶与空白凝胶的制备 将适量姜黄素溶于无水乙醇，以直接溶胀法制备微乳凝胶，制备方法同上，姜黄素凝胶含药量为2.5mg/mL。将泊洛沙姆407直接溶胀于蒸馏水中即制成空白凝胶。

2.3 小鼠皮肤纤维化模型制备 将70只SPF级BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、姜黄素微乳凝胶低剂量组、姜黄素微乳凝胶中剂量组、姜黄素微乳凝胶高剂量组、姜黄素凝胶组、阳性药（积雪苷软膏）组，每组10只，正常饲养于SPF级动物实验室内，给予SPF级饲料（由江苏省协同医药生物技术有限公司提供）饲养。实验前用电动剃毛剪将背部毛发剃除，面积1.5cm×1.5cm。采用博来霉素建立小鼠皮肤纤维化模型，用PBS液（pH7.2磷酸盐缓冲液）将博来霉素（BLM）配置成200μg/mL溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌后保存备用。造模时在小鼠背部中央剃毛处用博来霉素溶液作背部皮内注射，每日1次，每次0.1mL，共3周。正常组用PBS液0.1mL注射，方法同造模组。每日记录皮肤弹性及外观等大体变化，给药3周后，观察造模情况，60只博来霉素皮肤纤维化模型小鼠注射区皮肤活动度明显减弱，注射区皮肤与皮下组织粘连，初步确定造模成功。在之后的实验中处死小鼠，取注射区皮肤，进行组织学检查，确认造模均成功。

2.4 给药方案 正常组与模型组给以空白凝胶，0.5mL/次；姜黄素微乳凝胶低、中、高剂量组分别给予姜黄素微乳凝胶0.8、1.6、2.4mg/次；姜黄素凝胶组给予姜黄素凝胶，2.4mg/次；阳性药组给予积雪苷软膏，25mg/次。以上各组动物在成功造模后的次日开始给药，每日给药2次，连续3周。

2.5 指标检测 （1）动物血清中羟脯氨酸含量测定：实验结束时动物取血，2000r/min离心15min，取上清液，测定羟脯氨酸含量（采用碱水解法，按试剂盒说明书进行操作）。（2）处死小鼠，取背部中央约1.5cm×1.5cm大小皮肤，经过10%福尔马林液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片，HE染色，由专业病理人员在光学显微镜下阅片。应用医学彩色病理图像分析系统测定真皮厚度，每张切片随机取5处测皮肤厚度，取平均值。（3）免疫组化测定：ColⅠ、TGF-β、MMP-9，实验方法参照试剂盒说明书操作，棕黄色为阳性表达，应用Image-Pro Plus对实验结果图片进行分析。

2.6 统计学方法 相关数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，数据用（±s）表示，计量资料比较采用t检验，多组间计量资料的两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠羟脯氨酸含量比较 结果见表1。姜黄素微乳凝胶各剂量组组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表现出一定的剂量依赖性。

3.2 各组小鼠皮肤组织病理学观察与真皮厚度比较 各组小鼠真皮厚度比较结果见表2。姜黄素微乳凝胶各剂量组组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表现出一定的剂量依赖性。HE染色组织图见图1。除正常组外，其他各组小鼠皮肤组织学显示真皮层不同程度的增厚，真皮小血管周围出现不同程度的炎症细胞浸润，血管壁增厚，管腔变小或闭塞，皮肤附属器明显减少。阳性药组和姜黄素微乳凝胶高剂量组真皮纤维化程度明显减轻，浸润的炎症细胞明显减少；中剂量组和姜黄素凝胶组作用相近，略有改善真皮病变的作用；低剂量组则改善不明显。

表1 各组小鼠血清羟脯氨酸含量比较（±s）

表1 各组小鼠血清羟脯氨酸含量比较（±s）

注： 与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与阳性药组比较，#P＜0.05；与姜黄素凝胶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

正常组 10 0.170±0.004 70.68±1.55模型组 10 0.238±0.039△△ 98.62±16.36△△阳性药组 10 25 0.162±0.005** 67.12±0.03**姜黄素凝胶组 10 2.4 0.175±0.022**# 72.77±9.03**#姜黄素微乳凝胶低剂量组 10 0.8 0.180±0.011**# 74.53±4.51**#姜黄素微乳凝胶中剂量组 10 1.6 0.160±0.014**▲ 66.49±5.60**▲姜黄素微乳凝胶高剂量组 10 2.4 0.122±0.019ΔΔ**#▲▲ 50.62±7.77ΔΔ**#▲▲

3.3 各组小鼠皮肤组织中ColⅠ、MMP-9和TGF-β表达比较 结果 见 表3。 结 果 显 示，ColⅠ、MMP-9和TGF-β在模型组表达显著升高，在正常组则几乎无表达，提示皮肤纤维化与ColⅠ、MMP-9和TGF-β的高表达有相关性。姜黄素微乳凝胶各剂量组上述指标有不同程度的降低，高剂量组降低最为明显，且明显优于姜黄素凝胶组（P＜0.05，P＜0.01）。姜黄素微乳凝胶各剂量组组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表现出明显的剂量依赖性。

4 讨论

皮肤纤维化通常发生于硬皮病与皮肤瘢痕形成过程中，其主要特征为真皮层出现增厚，皮肤附属器毛囊、汗腺等出现阻塞，真皮小血管周围炎症细胞浸润，血管壁明显增厚，管腔变小或闭塞等[4]。皮肤纤维化是多个细胞因子参与的细胞间相互作用的结果，通常认为与ColⅠ、MMP-9和TGF-β等的异常表达有关。TGF-β是目前普遍认为与皮肤纤维化相关的因子，往往参与细胞分化、细胞凋亡、细胞动态平衡等多个过程，如TGF-β过高表达，能诱导成纤维细胞、胶原蛋白、层黏蛋白等的分泌及合成，并抑制其降解，从而导致细胞外基质（EMC）的沉积[5]，最终导致皮肤纤维化的产生。MMP-9属于基质金属蛋白酶（MMPs）家族，其主要功能是降解和重塑EMC的动态平衡。MMP-9与组织器官发生纤维化密切相关，Vassiliadis等[6]研究发现，MMP-9中的CO3-610片段与介导Ⅲ型胶原蛋白降解程度直接相关，在博来霉素皮肤纤维化小鼠中普遍高表达，提示MMP-9与皮肤纤维化发生发展直接相关。Kobayashi等[7]发现，MMP-9可通过激活TGF-β，诱导成纤维细胞生成，进而诱发组织纤维化。羟脯氨酸为胶原蛋白特征性的氨基酸，在创伤愈合及组织纤维化病变等方面有较高的预测价值，相关研究也常将血清羟脯氨酸含量作为纤维化程度的标志[8-9]。Ⅰ型胶原蛋白为结缔组织中的主要成分之一，其主要分布于皮肤和肌腱，是皮肤纤维化的重要指标。

表2 各组小鼠真皮厚度比较（±s）

表2 各组小鼠真皮厚度比较（±s）

注： 与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01 ；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01 ；与姜黄素凝胶组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数（只） 剂量（mg/次） 平均真皮厚度（μm）正常组 10 16.16±0.70模型组 10 48.18±0.57△△阳性药组 10 25 25.09±4.51△**姜黄素凝胶组 10 2.4 30.85±9.07△△**#姜黄素微乳凝胶低剂量组 10 0.8 38.10±2.36△△*##▲姜黄素微乳凝胶中剂量组 10 1.6 29.83±4.93△△**#姜黄素微乳凝胶高剂量组 10 2.4 24.48±3.21△**▲

图1 各组小鼠皮肤组织HE染色图

表3 各组小鼠皮肤组织中的COLⅠ、MMP-9和TGF-β表达比较（±s）

表3 各组小鼠皮肤组织中的COLⅠ、MMP-9和TGF-β表达比较（±s）

注： 与正常组比较，△△P＜0.01 ；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 ；与阳性药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与姜黄素凝胶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 动物数（只）剂量（mg/次） COLⅠ表达AOD值 MMP-9表达AOD值 TGF-β的表达AOD值正常组 10 0.003±0.001 0.036±0.007 0.008±0.002模型组 10 1.388±0.212△△ 1.272±0.077△△ 1.226±0.209△△阳性药组 10 25 0.408±0.076△△** 0.382±0.085△△** 0.396±0.055△△**姜黄素凝胶组 10 2.4 0.769±0.146△△**# 1.094±0.054△△*## 0.889±0.116△△**##姜黄素微乳凝胶低剂量组 10 0.8 1.239±0.174△△##▲▲ 1.193±0.114△△*## 1.115±0.127△△##▲姜黄素微乳凝胶中剂量组 10 1.6 0.982±0.214△△*##▲ 0.848±0.173△△**## 0.812±0.142△△**##姜黄素微乳凝胶高剂量组 10 2.4 0.503±0.073△△**▲ 0.523±0.106△△**▲▲ 0.587±0.074△△**#▲

姜黄素因具有多靶点的药理学作用而备受药学界的关注，其在逆转纤维化方面也有诸多报道[10-11]。一系列研究证实，姜黄素可多靶点逆转肝、肺、肾及皮肤的纤维化，涉及基因及蛋白包括IFN-γ、MCP-1、TGF-β、CTGF、VEGF、TNF-α、IL-1、ET-1、AngⅡ等[1]。由此可见，姜黄素在治疗纤维化和皮肤病领域有光明的前景。然而，药物的研发除了确切的药理作用和较小的毒性外，还需考虑其理化性质及生物药剂学特性。姜黄素属二酮类化合物，主链为不饱和脂族及芳香族基团，姜黄素不溶于水和乙醚，溶于乙醇和冰醋酸，在乙醇中的溶解度较小，仅为10mg/mL。此外，姜黄素在中性条件下不稳定，易水解为阿魏酸甲烷和阿魏酸[12]。姜黄素理化性质的缺陷限制了其的进一步开发和利用。以皮肤外用制剂为例，姜黄素虽可透过脂溶性的表皮，但其后在水性环境中可能释药缓慢，甚至尚未到达作用部位即被分解。因此，改变姜黄素的理化性质，对其的开发利用十分必要。微乳凝胶（microemulsion-based gels，MBGs）是在微乳中加入明胶、纤维素和卡波姆等水溶性高分子材料，形成透明和稳定的网状结构胶体[13]，是一种复合制剂，具有延长药物维持时间，改善透皮速率等综合优势。因此，将姜黄素制备成微乳凝胶，可有效改善其释药特性，增加黏性，改善涂布性和延展性，最终增加药效。本研究显示，姜黄素微乳凝胶在减小真皮厚度，降低血清羟脯氨酸含量，降低TGF-β、MMP-9及ColⅠ表达等方面均优于姜黄素凝胶，与阳性药积雪苷软膏（积雪苷软膏为目前临床治疗皮肤纤维化的一线用药）相似甚至更优。后续的研究应当进一步优化姜黄素微乳凝胶的给药剂量，并开展相关制剂的稳定性研究和中试生产研究，为姜黄素新剂型的进一步开发及临床应用奠定基础。