高效液相色谱法测定饲料中那西肽A

林仙军，陆春波，包爱情，王 彬

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州 311100）

那西肽（Nosiheptide）为浅黄绿褐色或黄绿褐色粉末，是一种带有5个噻唑环的含硫多肽类 抗 生 素 （ 孙 小 青 ，2007） 其 分 子 式 为C51H43N13O12S6，相对分子质量1222.36。那西肽能促进猪（沈顺新，2008）、鸡生长（Cromwell，1984），提高饲料效率 （Benazet，1980a、b）。 按那西肽 A计算，混饲每1000 kg饲料，猪2.5～20 g，鸡2.5 g（Yu，2009）， 广泛应用于畜牧业生产中（Jiang，2015）。饲料中添加浓度较低的那西肽即能促进畜禽生长 （Niu，2011）， 提高饲料效率（Wojtas，2016；Wang，2014；Pascal，1979）。

农牧函 〔1998〕7号批准那西肽及那西肽预混剂为国家三类新兽药。农业部第168号公告《饲料药物添加剂使用规范》将那西肽列为可在饲料中长时间添加使用的饲料药物添加剂。农业部公告第942号、第1204号、第1923号、第1960号和第2382号都涉及那西肽和那西肽预混剂的使用范围、规格和检测方法等内容。

目前，那西肽的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法（DB 34/T 1371-2011）、高效液相色谱紫外检测法（张秀英，2013；段红，2012；翟卫红，2011）、高效液相色谱荧光检测法（林仙军，2017；Horii，2000）和微生物检定法等。微生物检定法检测成本低，操作较为简便，一直是经典的那西肽含量的检测方法，目前《兽药国家标准》（化学药品、中药卷）第一册（农业部公告1960号）仍然使用此法检测。但由于微生物检定法灵敏度较差，检测周期长，不适宜批量检测，满足不了饲料中那西肽检测需要。高效液相色谱法因其选择性好、灵敏度高、速度快等优点，是现阶段比较理想的选择。农业部公告第2382号，发布的那西肽发酵液干燥品配制的那西肽预混剂质量标准中规定，采用高效液相色谱紫外检测法测定那西肽组分，其中就明确指出那西肽的出峰顺序为那西肽组分B、那西肽组分A，按峰面积归一化法计算，那西肽组分A的峰面积不得少于那西肽组分A和那西肽组分B峰面积之和的88.0%。因此，那西肽A是主峰，本检测方法只研究那西肽A。

由于那西肽在饲料中的添加量较低，因此，为了准确测定饲料中那西肽的含量，我们前期研究的高效液相色谱荧光检测法测定饲料中的那西肽，方法操作简便，灵敏度高。但是，由于饲料基质复杂，针对个别饲料存在加标回收率不理想的情况，主要针对饲料中那西肽A测定的前处理方法和干扰因素等进行了深入研究。通过实验得到了适用性更广的前处理方法。配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料检测限为0.2 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 那西肽对照品购自中国兽医药品监察所，批号为 K0431212，按C51H43N13O12S6计，含量88.6%，每1mg相当于928那西肽单位；乙腈、甲醇和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等为色谱纯；乙二胺四乙酸二钠、乙醇、丙酮、三氯甲烷和磷酸氢二钠等为分析纯；实验用水为milli-Q超纯水。Waters 2695-2475高效液相色谱仪 （配Empower 2软件）；梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）XS-205 电子天平（精度为 0.01 mg）；上海民桥精密科学仪器有限公司SL502 N电子天平（精度 0.01 g）；德国 Sigma公司 Sigma 3k30型冷冻离心机；昆山市超声仪器有限公司KQ-500E型超声波清洗器。

1.2 样品处理 称取配合饲料、浓缩饲料或添加剂预混合饲料2 g，精确至0.01 g，于50 mL离心管中，加入乙二胺四乙酸二钠溶液1.0 mL，再加入N，N-二甲基甲酰胺19.0 mL，振摇使样品完全分散、浸湿，置超声波清洗器中超声提取5 min，中间摇匀3次；取出，于10000 r/min离心5 min，过0.45μm有机滤膜，上机测定。

1.3 液相色谱参考条件 色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；荧光检测条件为激发波长327 nm，发射波长521 nm；流动相为 0.02%磷酸溶液+乙腈（60∶40，V/V）；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量为20μL。

1.4 线性相关实验 准确称取那西肽对照品适量，置于棕色容量瓶中，用适量DMF溶解，定容，摇匀，为标准储备液。准确吸取适量体积的标准储备液，用DMF稀释成含那西肽为0.02、0.05、0.1、0.5、2.5、5.0、10.0 μg/mL 的标准系列工作液。每个浓度进样2次，标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 提取溶剂的选择 那西肽在水、乙醇、丙酮和三氯甲烷中不溶或微溶，在乙腈和DMF中溶解。取空白鸡配合饲料2.0 g，添加那西肽，使其添加浓度分别为 0.5、2.0、5.0、10.0 mg/kg 和 50.0 mg/kg，分别加乙腈和DMF提取。结果两种溶剂对于添加浓度不大于10 mg/kg的提取效果基本一致，回收率均在90%以上；对于添加浓度大于10 mg/kg的提取，DMF提取效果远好于乙腈；当浓度为50 mg/kg时，乙腈提取的回收率只有60%左右。可能的原因是DMF对那西肽的溶解性较乙腈相对较大。因此，选用DMF为提取剂，可达到充分提取的目的。

2.1.2 提取溶剂体积的选择 以DMF作为提取溶剂，实验了以下几种提取方法，10 mL+10 mL、20 mL+20 mL和20 mL。结果回收率均在90%以上。由于饲料本身占一定的体积，DMF不能浓缩，2次提取会导致定量不准确的问题。因此，为了准确定量，便于操作，最后选择20 mL一次提取的方案。提取方法简单、快速。

2.1.3 初步确定的前处理方法及结果 称取配合饲料、浓缩饲料或添加剂预混合饲料2 g，精确至0.01 g，于 50 mL 离心管中，加入 DMF 20.0 mL，振摇使样品完全分散、浸湿，置超声波清洗器中超声提取5 min，中间摇匀3次；离心，过膜，测定。初步确定的前处理方法，对于少量随机抽取的样品，回收率结果较好。但加大样本数量，发现配合饲料回收率符合要求，浓缩饲料和添加剂预混合饲料有个别样本回收率低。推测可能是饲料中金属离子浓度太高，导致那西肽降解。后面进行了模拟实验，添加高浓度的铜、钙和镁等离子，最后，排除了这种推测。

2.1.4 前处理方法的改进 称取回收率较低的浓缩饲料C、添加剂预混合饲料D和E进行实验，取2.0 g，精确至0.01 g，于50 mL离心管中，加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，再加入DMF。具体操作方法见表1。振摇使样品完全分散、浸湿，置超声波清洗器中超声提取5 min，中间摇匀3次；取出，于10000 r/min离心 5 min，过 0.45μm有机滤膜，上机测定。加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液和DMF提取体积对回收率的影响结果见图1。

表1 乙二胺四乙酸二钠溶液和DMF提取体m积L

图1 乙二胺四乙酸二钠溶液和DMF对回收率的影响

2.2 荧光检测条件的确定 目前，国内外文献报道液相色谱法测定那西肽的方法中，检测器包括紫外检测器和荧光检测器两种。紫外检测器的波长包括330 nm（翟卫红，2011）和241 nm（段红，2012），实验中发现检测灵敏度低，杂质干扰比较严重，不能满足检测。本文参考文献中的方法（林仙军，2017；Horii，2000），采用荧光检测器进行检测。将仪器的激发波长设定为200nm，发射波长扫描范围暂设定为210～800nm，发现发射波长在521 nm处有最大吸收；将521 nm的波长作为发射波长固定下来，再做激发波长的扫描，激发波长的范围要小于发射波长，发现激发波长在327 nm处有最大吸收。因此确定荧光检测条件为激发波长327 nm、发射波长521 nm。

2.3 色谱柱的选择 研究了不同色谱柱作为分离柱的效果，分别对Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm） 柱、Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等 3 种规格的色谱柱进行了比较，结果表明分离结果均较为满意。

2.4 流动相的选择 在流动相选择上，比较了磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸溶液-乙腈和水-乙腈体系的色谱保留性能和灵敏度，结果发现磷酸溶液/乙腈流动相体系的那西肽峰型最好、灵敏度最高。通过进一步优化磷酸溶液浓度和流动相配比，使那西肽获得最佳峰型和保留时间，最终确定流动相为 0.02%磷酸溶液/乙腈为（60∶40，V/V），流速为1.0 mL/min。

2.5 线性考察、检测限和定量限 取配制的标准系列工作溶液进样检测，以峰面积Y对浓度X（μg/mL）作标准曲线，以那西肽A峰得出回归方程为 Y＝6.6176×105X-2.9747×104，相关系数 R2为0.9999，那西肽A在0.02～10.0μg/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系。当饲料中添加那西肽A 为 0.5 mg/kg时，信噪比（S/N）大于 10，为定量限；当饲料中添加那西肽A为0.2 mg/kg时，信噪比（S/N）大于 3，为检测限。

2.6 方法的准确度和精密度实验 分别取相应的代表性饲料，进行加标回收率实验。每批次内同一浓度做5个平行。典型色谱图见图2～图8，回收率实验结果见表2。

图2 对照品溶液（0.1μg/mL）色谱图

图3 浓缩饲料空白的高效液相色谱图

图6 配合饲料（添加浓度为1 mg/kg）色谱图

图7 预混合饲料空白色谱图

图8 预混合饲料（添加浓度为1 mg/kg）色谱图

表2 不同饲料那西肽回收率实验结果（n=5）

2.7 抗干扰实验 为了研究本方法的专属性，考察了目前养殖环节常用的药物对那西肽分析的干扰，分别是盐酸金霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素、替米考星、氟苯尼考、阿莫西林、喹乙醇、乙酰甲喹、土霉素、恩诺沙星、林可霉素、4-差向金霉素以及多肽类抗生素黏菌素、恩拉霉素、杆菌肽锌等15种药物。分别取上述标准品（对照品）约10 mg，用DMF溶解后，定容至200 mL，上机检测。结果显示，在该条件下以上药物除恩诺沙星在保留时间约为2 min的时候出现色谱峰，其余药物在该色谱条件下均未检测出色谱峰，色谱图见图9。因此，对那西肽A检测没有干扰，表明本方法具有很强的专属性。

2.8 那西肽降解因素考察 那西肽A作为多肽类抗生素，其贮藏条件要求密闭、阴凉干燥。那西肽A溶液在光照、高温、碱、高湿、金属离子和氧化等条件下易降解。取那西肽A标准溶液（100 μg/mL）1.0 mL，置 100 mL 量瓶中，进行室温、避光、不避光、254 nm强光、4 ～20℃等保存24 h后测定。结果，24 h内，温度和日光照射影响较小；254 nm强光照射影响较大，下降了近50%。因此，在实际的实验操作中要避免强光的照射。那西肽A在氢氧化钠溶液中不稳定，已降解完全，剩余那西肽A为0；在过氧化氢溶液中约降解10%；在盐酸溶液中稳定，几乎没有降解。因此，在样品前处理时要综合考虑，减少或避免这些不利因素的干扰，保证样品检测条件的一致性和稳定性，确保检测结果的准确。

图9 抗干扰实验混合标准品溶液（50 μg/mL）色谱图

2.9 实际样品检测 采用建立的检测方法对市场随机抽取的配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料样品各15份进行检测，结果检出2个，浓度分别为 20.6 mg/kg和 9.6 mg/kg。

3 结论

本文对饲料中那西肽A测定的前处理方法、色谱条件、影响因素和抗干扰因素进行了研究。建立了饲料中那西肽A检测的方法，结果稳定、可靠，配合饲料添加浓度为0.50～10.00 mg/kg时，平均回收率为89.5%～95.0%，相对标准偏差（RSD）为3.9%～5.5%；浓缩饲料添加浓度为0.50～100.0 mg/kg时，平均回收率为81.9%～88.6%，相对标准偏差（RSD）为2.5% ～8.9%；预混合饲料添加浓度为0.50～500.0 mg/kg时，平均回收率为81.6%～95.6%，相对标准偏差（RSD）为1.6%～5.5%。这表明用此方法检测饲料中那西肽A的适用性更强了。