小尾寒羊血清对氧磷酶活性与繁殖力之间关系研究

马冬伍

(沈阳市沈北新区动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110121)

对氧磷酶(paraoxonase,PON)基因家族有三个成员,包括PON1、PON2和PON3。其中PON1也称作血清对氧磷酶，它是一种广谱非专一性脂酶,可以水解有机磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸脂等，重要的是具有抗氧化损伤、脂质过氧化及参与抵御外来毒性的作用。在哺乳动物体内血清对氧磷酶主要由肝脏分泌，分布于血液、肝脏、脾脏及脑组织等，血清中PON1与高密度脂蛋白(HDL)紧密结合从而发挥功能。而反刍动物卵泡液中的HDL是主要脂质体蛋白，它是与PON1结合后由血液循环进入卵泡的。由于PON1在胚胎早期发育过程中的抗氧化性，使得PON1在卵泡液中的活性与胚胎发育有直接的关系，因为活性氧(ROS)的产生与抗氧化作用之间平衡是胚胎正常发育的关键因素之一。因此，对PON1的检测可能作为动物繁殖能力的一个标记，本文对小尾寒羊血清和卵泡液中的PON1进行了检测，并分析了血清中PON1浓度与繁殖力之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试验羊的准备

选择雌性小尾寒羊 55只，56.4±1.1 Kg，22±3.5 月龄，所有羊经过驱虫、免疫，体格健壮，无生殖系统疾病等。所有羊只圈养，按照国家标准“小尾寒羊饲养方法DB22/T 917-1998”进行饲养和管理。

1.2 血清采集与卵泡液准备

随机选择50只羊作为试验羊，5只作为对照，不进行任何处理。用自制醋酸甲羟孕酮海绵栓处理，放栓当天为第1天，第14 天傍晚撤栓；从第1天开始，隔天采集所有羊只外周静脉血，离心收集血清，直到第17天。第15天早上到第17天傍晚部分发情的羊只用于子宫颈口输精，剩下羊只于第17天屠宰，分离双侧卵巢，在无菌条件下采用抽吸法抽取卵泡液，收集上清液，于低温保存。输精30 d后用超声波诊断仪进行妊娠诊断。

1.3 PON1检测

确定对硝基酚吸收光谱与摩尔吸光系数，先配制对硝基酚的标准溶液,进行连续系列稀释后,测定中间有代表性的标准液在不同波长下的吸光值,确定最大吸收峰，从而在该吸收峰情况下再测定其他浓度的标准溶液，制作标准曲线。

测定PON1活性时，酶促反应缓冲液保护含0.4 mol/L甘氨酸、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L对氧磷、pH =10，样品为10 L。在罗氏MODULARP800全自动生化分析仪上进行样品测定，PON1活性根据如下公式计算 ：PON(U/ml)=ΔA /min×TV×103/(ε×SV×L )。其中ΔA/min为每分钟吸光度变化值，TV为反应总体积(ml)，SV为样本体积(ml), L为比色杯光径(1 cm), 103是将mol换算成mol的系数，?为对硝基酚的摩尔消光系数(cm2/mol)。同时用生理盐水进行阴性对照。

1.4 试验设计

1.4.1 卵泡大小与PON1活性关系试验 屠宰的羊只，分离卵巢，无菌条件下计算卵泡总数，用微标卡尺测量卵泡直径，直径小于4 mm的卵泡为小型卵泡，直径在5～12 mm的为可用卵泡，而大于13 mm的为大卵泡，抽吸卵泡液，每一只羊各种类型的卵泡液集中在一起，离心后待测定。

1.4.2 卵泡液中PON1与外周血PON1活性关系测定 将从第1天至17天隔天采集的血液以600 r/min离心5 min，去掉底部沉淀，收集上面的血清，每只羊每次血清单独存放，待用。

1.4.3 外周血PON1活性与繁殖能力之间关系试验 屠宰后剩下的表现发情的羊只，用来自同一公羊的冷冻精液进行人工输精，隔12 h后再输精1次。观察第1个情期返情羊只，30 d后进行妊娠诊断，最后记录、分析产羔率。

1.5 统计分析

采用统计软件SAS 9.2进行统计分析， 所有结果以平均数±标准差表示，用广义线性模型分析不同类型卵泡直径和PON1浓度的变化差异，采用线性回归模型验证血清与卵泡液中PON1关系及血清PON1与繁殖力之间的关系。用单因素方差分析发情率、返情率、妊娠率及产羔数，P<0.05为差异显著，而P<0.01为极显著。

2 结果

2.1 不同类型卵泡之间 PON1活性比较

根据绵羊卵泡体外培养特点，将卵泡分为小、中、大三种类型，大量的试验发现，小型卵泡属于无用卵泡，无论是分离卵母细胞还是卵泡直径培养，都逐渐走向凋亡；中型卵泡内的卵母细胞是目前最具有发育能力的，而大型卵泡一般都是发育异常的，其中的卵母细胞发育能力低下。从图1可以发现，大型卵泡内PON1活性和小型卵泡相比差异不显著，而两者显著低于中型卵泡内的PON1活性。

2.2 血清中PON1活性与发情表现之间的关系

图1 卵泡大小与PON1活性之间关系

图2 同期发情处理期间血清中PON1活性变化

从放栓当天开始采集外周血，检测血清中PON1活性，第14 d傍晚撤栓，第15 d早上开始用公羊试情，有发情表现的羊进行输精，在第17 d屠宰3只非发情羊和8只发情羊。从图2中可以看出，未表现发情的羊只血清PON1与未加任何处理的对照组羊相比，无显著差异，而两者现在低于具有发情表现的羊；对照组羊血清PON1几乎无变化。

2.3 卵泡液与血清PON1关系

由于对卵泡液的检测比较困难，如果能确定血清中PON1的活性与卵泡中的关系，那么今后就可以直接检测血清中的PON1就可以判定卵泡的功能。因此，对屠宰的8只表现发情的羊只血清PON1平均值与其相应的卵泡液中PON1进行比较，从图3可以发现，8只表现发情的羊卵泡中的PON1与其血清中的PON1成正相关，且相关性极强。

2.4 血清PON1与繁殖力之间的关系

图3 卵泡液与血清中PON1相关性分析

图4 不同产羔数母羊血清PON1比较

同期发情处理50只羊，发情率为94.0%，人工输精后第一个情期返情率为4.4%，妊娠率为95.6%，而妊娠期间2只羊出现不明原因的流产。最终分娩率为95.6%，分娩后产单羔率为46.7%，双羔率为44.4%，三羔率为4.4%，因此，总产羔率为155.8%。另外，从图4可以发现产双羔和产三羔母羊之间血清PON1无显著性差异，产单羔母羊血清PON1活性与全部羊群血清PON1平均值之间无显著性差异，但是显著低于产双羔和产三羔母羊血清PON1值。

3 讨论

PON1在血液循环过程中与高密度脂蛋白(HDL)紧密结合，保护细胞、脂质体及低密度脂蛋白(LDL)避免过氧化物的损伤作用。而在卵泡液中的蛋白以HDL为主，因此，PON1在卵泡的发育成熟过程中具有重要意义。迄今，国内关于PON1活性与绵羊繁殖力之间关系的研究从未见报道。国内目前多数采用ELISA方法对人外周血PON1进行检测定量，其利用抗原抗体特异性结合原理，成本较高，尤其是对于本实验样品较多，需要花费更多的人力财力。因此，我们检测PON1的原理是PON1可以催化对氧磷水解产生黄色的对硝基酚，而对硝基酚在412 nm处有最大吸收峰，可以通过测定酶促反应时吸光度的变化来反映酶活性。因此，对硝基酚的量可反映PON1的活性，本试验过程中采用速率法进行检测，试剂自己配制，相对而言经济实惠，也是国外多数实验室采用的方法。

试验根据(Lundy T，et al.,1999)对屠宰的羊卵泡进行分类，结果发现卵泡大小与PON1活性之间有一定的关系，可用卵泡PON1活性平均值为180.1±5 U/ml，但是小型和大型卵泡内PON1都过低，初步说明PON1在卵泡液中的抗氧化功能过低不利于其发育分化。同期发情处理后，表现发情的羊外周血中的PON1活性显著高于非发情羊只和未进行同期处理的羊只，并且，在同期处理期间，PON1上升趋势比较明显，虽然未表现发情的羊血清PON1也具有上升的趋势，但是仍不足以维持发情的需要，也就是仍然低于发情需要的阈值。说明绵羊发情前PON1活性必须高于这个阈值才能正常输精，说明而同期处理后未表现发情的羊与较低的PON1活性有关。

在进行卵泡液PON1与血清PON1之间的关系分析时，发现屠宰的8只发情羊卵泡液PON1活性普遍低于血清中的活性，并且他们之间呈现线性关系(r2=98, P=0.0001)，因此，基本可以用外周血PON1活性代替卵泡液中的PON1。Pradieé等(2007)采用试剂盒对牛外周血清和卵泡液中的PON1进行比较，发现血清中的PON1活性普遍比卵泡液中的高2-3倍 ，并且通过基因表达分析发现，PON1基因不在颗粒细胞中表达，说明卵泡液中的PON1来源于血液循环，这与本实验得出的结果基本一致。

此外，小尾寒羊为高产品种，试验过程中发现产双羔和三羔的羊外周血中的PON1要显著高于产单羔的羊，而前两者之间差异不显著；并且所有羊群的PON1平均值与产单羔羊之间差异也不显著。说明根据外周血中的PON1活性可以初步判断羊只的羊只妊娠、分娩情况，尤其是对是否产双羔或三羔具有较准确的判断。

因此，在对小尾寒羊进行同期发情处理后，卵泡直径大小与PON1活性有较大的相关性，卵泡直径过大或过小会导致卵泡液中的PON1活性过强或过弱，都不利于随后的受精；具有发情表现的羊外周血清中PON1要显著高于无发情表现的羊只；正常的具有发情表现羊只卵泡液中的PON1与其外周血相比，具有极强的相关性，说明卵泡液中的PON1来源于外周血液循环；此外，根据外周血液中的PON1活性可以基本判断该羊输精后能否妊娠，是否产双羔或三羔。该结果可以提高绵羊辅助生殖技术的成功率，对促进肉羊快繁具有现实意义。