miR-203表达异常与甲状腺乳头状癌发生发展的关系

戴磊，吴贤江，张舟径，李健君

甲状腺癌的发病率近年来逐步上升，已成为最常见的内分泌恶性肿瘤[1]。新病例在全世界范围内几乎为300000例，平均年龄为50岁，每年有近40000人死亡[2]。而甲状腺乳头状癌（PTC）正是所有甲状腺恶性肿瘤中最常见的病理分型，其发病率也在逐年上升[2]。进一步了解甲状腺乳头状癌发生及发展的分子学机制有助于进一步提高患者的生存率，并为一些中晚期的特殊患者提供新的治疗方案。miRNAs是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，从而进一步调控某些关键蛋白的表达[3]。该类分子在人类恶性肿瘤的发生和发展过程中也起到了重要的生物学作用，目前已知的与甲状腺乳头状癌密切相关的 miRNA有：miR-146b，miR-222，miR-221和miR-151；而miR-222，miR-221与甲状腺乳头状癌细胞的迁徙性更有着密切的关系[4-5]。而外周循环血中miR-222和miR-146b的水平被报道与甲状腺乳头状癌的不良预后相关。研究表明miR-203在胃癌、直结肠癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌及皮肤黑色素瘤的发生及发展过程中均起到了关键的作用[6-9]。而miR-203与甲状腺乳头状癌之间的关系并没完善的研究进行报道。本研究通过实验对miR-203在甲状腺乳头状癌中的表达情况及目标基因进行了验证，进一步阐述了miR-203生物学作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集宁波市第二医院甲状腺外科2016年3月到2017年3月行甲状腺手术患者病理标本70例，其中甲状腺乳头状癌标本40例，甲状腺良性肿瘤标本30例。新鲜标本均在手术后立即于液氮存放，所有甲状腺乳头状癌标本均由细针穿刺、术中冰冻病理及术后常规石蜡标本3次确认。其中10例甲状腺乳头状癌及10例匹配对照甲状腺良性肿瘤组织用于基因芯片使用。人甲状腺滤泡细胞细胞系为：Nthy-ori3-1；人甲状腺乳头状癌细胞系包括：HTH83、NIM-1和TPC-1，上述四株细胞系均购买于上海中国科学院细胞库，用10%胎牛血清（HyClone、Logan，USA）及 100 U/ml青霉素的 DMEM（Gibco、Carlsbad，USA）培养基培养，培养环境为37℃的含5%CO2的湿润空气。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖 细胞在转染后24 h接种于96孔板，5 000细胞/孔。接种48 h后CCK8试剂盒（Dojindo、Kumamoto、Japan）计数，450nm吸光度由全自动酶标仪（SpectraMax190，USA）测量。

1.2.2 细胞侵袭 接种1×104培养细胞于用Matrigel（BDBiosciences）覆膜的Tranwells上腔室，待Matrigel干燥后，抽去上层的DMEM，用500lPBS冲洗凝胶。培育24 h后将未透膜的细胞小心擦除，甲醇固定后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，每膜用荧光倒置显微镜随机取5个视野并计数。

1.2.3 RNA提取及反转录荧光 PCR 细胞及组织总RNA使用Trizol（LifeTechnologies，USA）按照说明书提取并于－80℃保存备用。使用TaqMan反转录试剂盒合成总cDNA后由特异性引物按照SYBR Green（Finzyme）试剂盒要求行荧光PCR检测，定量计算内参选择为：mRNA参照GAPDH；miRNA参照miR-16。

1.2.4 Western blot检测 细胞及组织总蛋白由RIPA（Thermal）及蛋白酶（Sigma-Aldrich）预混液制备，10%SDS-PAGE电泳后转膜（RocheDiagnostics，Switzerland）。5%脱脂牛奶阻断后，转膜由特定抗体孵育过夜。

1.2.5 荧光素酶检测 将用荧光素标记酶标记3’-UTR（野生和变异型survivin）的HEK 293T细胞接种于24孔板，加入10ngpRL-TK和20pmolmiRNA模拟品。用双荧光素酶报告试剂盒（Promega、Madison，USA）在转染后48 h检测荧光量。

2 结果

2.1 miR-203在甲状腺乳头状癌及癌细胞系中表达miR-203在甲状腺乳头状癌及3株甲状腺乳头状癌细胞系中表达较正常甲状腺组织表达明显下降（封二彩图1）。

2.2 细胞内过表达miR-203与甲状腺乳头状癌发生发展的关系 CCK8实验和细胞凋亡实验均证明在转染miR-203模拟品组对比miR-NC组中肿瘤细胞的活性被明显抑制，而凋亡水平明显上升（封二彩图2）。Transwell实验证实miR-203对肿瘤细胞侵袭力的影响，转染miR-203 TPC-1细胞恶性程度和侵袭力均明显下降。

2.3 miR-203和目标基因survivin之间的关系 在甲状腺乳头状癌标本及乳头状癌细胞系中 survivin mRNA及蛋白的表达量均有所上升（封二彩图3）。分别在TPC-1细胞中建立了野生型和突变型survivin3′UTR的荧光素酶检测系统，发现miR-203能成功阻断含野生型survivin3′UTR的荧光素酶而对突变型无效（封二彩图3C）；同时转染miR-203 siRNA阻断miR-203的TPC-1细胞中survivin的表达量明显上升（封二彩图3D、E）。

2.4 miR-203启动子区乙酰化与miR-203表达的关系 经TSA处理的TPC-1细胞miR-203表达量显著增加并随TSA剂量的增加而增加（图1）。

3 讨论

甲状腺乳头状癌（PTC）是目前临床上最常见的甲状腺恶性肿瘤，早期没有特异的临床表现，这使该疾病的早期诊断变得困难重重[10]。大多数患者预后良好，10年生存率约为90%。然而，淋巴结转移的发生率却高达20～50%[2]，而PTC患者接受全甲状腺切除术的区域复发率为5～20%[4]。目前常用的治疗手段有手术治疗、内放射治疗及内分泌抑制治疗，在非远处转移的患者中治疗后的5年生存率超过95%。但是仍有部分患者有远处转移及局部淋巴结的复发，而这一情况在某些特殊的甲状腺乳头状癌病理分型中尤其明显，而有远处转移或局部淋巴结复发的患者的5年生存率则降至59%[11]。

图1 阻断启动子区乙酰化导致miR-203表达量上升

miRNAs是一类非编码短RNA，在细胞活动的周期里起到重要的调节作用，在多种恶性肿瘤包括甲状腺癌中miRNA也起到了重要的作用[12]。已有研究发现miRNAs通过调制肿瘤形成发生的途径从而在致癌和肿瘤抑制中的作用。此外，几个miRNAs被报道与肿瘤的增殖、进展、转移和侵袭密切相关[12]。miR-146b[13]，miR-222[14]及 miR-20b[15]均被研究者证明在甲状腺乳头状癌的发生发展过程中能起到促进或是抑制的作用。但同时更多的miRNA的生物学作用和分子机制尚需进一步研究。

有报道称miR-203在皮肤黑色素瘤[8]及非小细胞肺癌[12]均低表达，这提示miR-203可能在更多的恶性肿瘤中起到关键作用。本研究通过Affymetrix芯片发现miR-203在甲状腺乳头状癌中表达也被抑制，但其生物学作用及分子学机制未被详细报道。因此继续通过靶基因预测软件预测了survivin可能是miR-203的上游调节基因。相关报道描述 survivin在甲状腺乳头状癌及局部转移的淋巴结标本中均有很高表达[16]，考虑survivin与甲状腺乳头状癌的发生、淋巴结转移及预后判断均有密切关系。本研究发现miR-203表达情况与survivin表达呈现相反变化趋势，进一步完善了survivin与甲状腺乳头状癌之间关系的研究。同时本研究还发现启动子区乙酰化是造成miR-203表达降低的重要的机制。

通过本研究，笔者总结如下：（1）PTC组织中miR-203表达较正常组织明显减少；（2）阻断miR-203的表达会导致甲状腺乳头状癌细胞系细胞中survivin过表达；（3）阻断乙酰化可使肿瘤细胞内低表达的miR-203表达量恢复正常。以上结论均说明miR-203在甲状腺乳头状癌发生过程中起到重要作用，而作为可检测的小分子，miR-203极有可能成为甲状腺乳头状癌的诊断或预后判断的肿瘤标志物；同时作为可被调控的生物靶点，miR-203也可作为今后靶向治疗的关键靶点。