依达拉奉对高胆红素血症新生大鼠血清NSE的影响

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新生儿高胆红素血症(neonatal hyperbilirubinemia)是新生儿期常见的疾病之一。近些年其发病率高达30%～50%，占新生儿住院原因的首位[1]。如果病情重且治疗不及时，可造成神经系统后遗症，如听力障碍、运动障碍及智力低下等，甚至死亡。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)主要表达于中枢神经系统和内分泌组织细胞胞浆内，近些年来人们逐渐认识到NSE可作为高胆红素血症脑损伤的早期检测指标[2]。依达拉奉(edaravone)是一种脑保护剂，现已被应用于神经系统疾病的治疗中[3-4]。但依达拉奉应用于高胆红素血症脑损伤的研究国内外鲜有报道。本实验通过观察新生SD(sprague-dawley)大鼠高胆红素血症时使用依达拉奉干预后各时间点脑组织病理变化及血清中NSE水平的变化，探讨依达拉奉对高胆红素血症新生大鼠有无神经保护作用，为依达拉奉在新生儿高胆红素血症脑损伤的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 晶体胆红素，购自美国Sigma公司；鼠NSE ELISA试剂盒，购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；依达拉奉注射液(商品名：易达生，20 mL∶30 mg)，由吉林省博大制药有限责任公司提供。

1.2 动物分组 选择7 d龄SD大鼠72只，将其随机分为3组：高胆红素血症组、依达拉奉干预组、正常对照组，每组24只。每组又随机分为3个亚组：12 h组、24 h组、48 h组，每个亚组8只。

1.3 动物实验

1.3.1 胆红素的配制 在避光条件下称取40 mg的晶体胆红素，立即溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中，再加入双蒸水9 mL，用0.5 mol/L的HCl调至pH8.5，并保证于1 h内使用。

1.3.2 新生大鼠高胆红素血症模型的制备 参照文献[5]，采用腹腔注射的方法，高胆红素血症组以及依达拉奉干预组新生大鼠按100 μg/g的剂量注入胆红素1次，建立高胆红素血症动物模型。正常对照组新生大鼠腹腔注入等体积的生理盐水1次。依达拉奉干预组在造模后立刻给予新生大鼠依达拉奉2 mg/(kg·d)腹腔注射，持续2 d。

1.4 标本的获取与实验

1.4.1 血清标本 分别于各时间点用5%的水合氯醛将新生SD大鼠麻醉，行心脏采血，置于管中，离心取血清，于-80 ℃冰箱保存，随后用酶联免疫的方法检测各组血清NSE水平。

1.4.2 脑组织标本 取血之后灌注生理盐水和甲醛溶液，之后断头取脑组织，于10%甲醛溶液中固定1 d后石蜡包埋，行石蜡切片，置于载玻片上，HE染色，随后封片，显微镜下观察脑组织的病理变化。

2 结 果

2.1 脑组织病理学观察 正常对照组HE染色海马区细胞排列整齐，细胞形态结构完整，无明显细胞水肿；高胆红素血症组可见海马区细胞排列略紊乱，细胞水肿明显；依达拉奉干预组于各个时间点脑组织病理变化较高胆红素血症组轻。详见图1～图3。

HE染色 12 h(100×) HE染色 24 h(100×) HE染色 48 h (100×)图1 正常对照组脑组织病理学观察

2.2 血清NSE含量 高胆红素血症组12 h、24 h、48 h血清NSE水平均高于依达拉奉干预组、正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；依达拉奉干预组12 h、24 h、48 h血清中NSE水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；正常对照组12 h、24 h、48 h血清中NSE含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组不同时间血清NSE比较(±s) ng/mL

3 讨 论

NSE主要表达于中枢神经系统及内分泌组织细胞胞浆内。有研究表明，血浆NSE是在非侵入条件下可量化神经元损伤程度的实验生物学标志物[6]。近年来，动物实验研究发现，NSE水平与高胆红素血症脑损伤密切相关[7-8]。Akman等[9]研究发现，高胆红素血症听力损伤婴儿血清NSE水平有增高趋势。国内研究也认为，血清NSE可作为高胆红素血症脑损伤的标志物，并可判断脑组织损伤的严重程度[2，10]。本实验结果显示，腹腔注射胆红素造模12 h后，血清NSE水平增高，24 h、48 h进一步增高。高胆红素血症组12 h、24 h、48 h血清NSE水平均较正常对照组明显增高(P<0.05)，与Bortolussi等[8]的实验结果相符。其原因可能是高胆红素血症时，血清中胆红素通过血-脑脊液屏障进入中枢神经系统，导致神经元肿胀、变性、坏死等，进而神经元胞质中表达的NSE漏出至脑脊液、血液中，随着神经元损伤的逐渐加重，外周NSE水平逐渐增高。

依达拉奉是一种脑组织保护剂。Itoh等[11]及Munake等[12]的研究证实依达拉奉有明确的神经保护作用。依达拉奉的神经保护作用可能是通过清除自由基、抑制脂质过氧化[13]、抑制血管痉挛[14]等机制实现的。刘霄等[15]研究显示，依达拉奉可减少脑缺血损伤病人血清中NSE含量，有助于脑损伤后神经功能的恢复。本实验对24只高胆红素血症新生大鼠进行依达拉奉干预，发现干预后12 h、24 h、48 h血清NSE水平较高胆红素血症组明显降低(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.05)。该实验结果显示，依达拉奉对高胆红素血症新生大鼠有脑保护作用，然而依达拉奉干预组血清NSE水平仍高于正常对照组，可能是依达拉奉干预2 d后仍有不同程度的脑损伤，尚未完全修复。

综上所述，本实验认为依达拉奉可以降低高胆红素血症新生大鼠血清NSE水平，对高胆红素血症新生大鼠有脑保护作用。然而依达拉奉对高胆红素血症脑损伤的修复机制尚不明确，依达拉奉的儿童用量、疗程、不良反应等方面尚需要进一步研究。