大陵穴对大鼠踝部损伤成纤维细胞修复的影响※

涂国卿 邹来勇 曹耀兴 朱玉辉 李 丰

（江西中医药高等专科学校附属医院针灸科，江西 抚州 344000）

踝关节扭挫伤是临床常见病、多发病，导致患部疼痛、瘀肿及功能障碍等，严重影响患者的生活质量。目前临床治疗方法多为中草药外敷，很少有针刺治疗者[1]。本研究通过平衡针刺大陵穴，分析平衡针刺大陵对踝部软组织损伤修复的影响，探索软组织损伤修复与成纤维细胞这一关键的细胞信号通路的具体关系，为临床应用提供实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组及造模 93只体质量为 (200±10)g的清洁级Wistar种大鼠，在相同条件下单笼适应性喂养半月后。用10%硫化钠溶液脱除大鼠左后腿踝部鼠毛，用自制撞击器 (质量120 g)，固定高度，撞击接触面（直径0.4 cm），在大鼠左后腿踝部外侧连续打击4次，造成局部软组织损伤模型。造模成功后将大鼠随机分为空白对照组、常规针刺组及平衡针刺组，每组31只。

1.2 动物干预方法

1.2.1 空白对照组 不进行针刺，常规喂养及观察。

1.2.2 常规针刺组 选取病变部位昆仑、丘墟、解溪、太溪。常规酒精棉球消毒，采用提插针刺手法，直刺0.2～0.3寸，留针15 min。

1.2.3 平衡针刺组 穴位定位参照李忠仁主编的《实验针灸学》“常用实验动物针灸穴位”，大陵穴：腕关节内侧横纹中心，桡侧腕屈肌腱与指浅屈肌腱之间。根据“病在左，取之右”及突出单穴疗法之原则，都取右侧大陵穴。选用13 mm 0.5寸一次性毫针，常规酒精棉球消毒，采用提插针刺手法，直刺0.2～0.3寸，以大鼠出现剧烈的抽搐样表现为宜，快速针刺，快速出针不留针。

以上3组，每天治疗1次，连续治疗21 d。实验过程中，每天观察伤肢肿胀和瘀斑等症侯。

1.3 组织学检查 组织学观察评分标准：6分：软组织同正常组织；4分：肌纤维肿胀，肌组织内瘀血、水肿、出血灶明显减轻或大部分消失，血管增生，胶原纤维增生，已基本恢复正常；2分：肌纤维肿胀伴有变性，肌组织内瘀血、水肿、出血灶稍有减轻或部分消失，纤维母细胞侵入，血管增生或胶原纤维增生，与对照组相比较略有减轻；0分：肌纤维肿胀伴有透明样变性，肌纤维明显坏死，肌纤维组织内伴有严重瘀血、水肿、出血。

1.4 成纤维细胞免疫组织化学检测 于术后21 d处死大鼠，并取损伤处瘢痕的软组织，体积分数为4%的甲醛固定，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，将蜡块标木切成5 μm厚的石蜡切片，对石蜡切片脱蜡后行苏木精-伊红染色，并在光镜下进行组织形态学观察。

免疫组织化学检测:采用链霉亲和素-过氧化酶连接法 (SP法)检测增殖细胞核抗原。二甲苯脱蜡，乙醇逐级 (体积分数为100%→体积分数为95%→体积分数为80%→体积分数为70%)至自然水化，蒸馏水洗；采用0.01 mol/L构椽酸钠缓冲溶液，高温高压修复抗原；蒸馏水洗，PBS 5 min冲洗3次；体积分数为3%的H202阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS 5 min冲洗3次；滴加适当比例稀释的增殖细胞核抗原单克隆抗体，4℃过夜；PBS 5 min冲洗3次，滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育40 min；PBS 5 min冲洗3次，DAB显色液；苏木精液复染细胞核1 min，体积分数为95%、体积分数为100%的乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。每批染片均有已知阳性同一蜡块作阳性对照，及PBS为一抗做阴性对照。细胞核呈黄色或棕黄色者为阳性。在显微镜下每张切片随机选择5个视野 (每个视野中至少200个细胞)，计数增殖细胞和正常细胞数目，按公式：增殖指数 (%)=增殖细胞数/总细胞数×100%计算增殖细胞占总细胞数的比例，并计算出平均增殖指数。

1.5 统计学方法 数据处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料用平均值±标准差 （±s）表示，结果以P<0.05为差异显著的标准。

2 结果

2.1 组织学观察评分 结果显示：治疗前各组评分比较无明显差异（P>0.05）；治疗前后各组比较，平衡针刺组有显著性差异（P<0.01），常规针刺组有显著性差异（P<0.05），空白对照组没有显著性差异（P>0.05）；治疗后各组比较，平衡针刺组与常规针刺组及空白对照组比较都有显著性差异（P<0.01），常规针刺组与空白对照组无显著性差异（P>0.05） （见表1）。

表1 3组治疗前后组织学评分 （±s，分）

表1 3组治疗前后组织学评分 （±s，分）

注：治疗前各组比较，1）P>0.05。治疗前后各组比较，平衡针刺组，2）P<0.01；常规针刺组，3）P<0.05；空白对照组，4）P>0.05。治疗后各组比较，平衡针刺组与常规针刺组及空白对照组，5）P<0.01；常规针刺组与空白对照组，6）P>0.05

组别 只数 治疗前 治疗后平衡针刺组 31 0.50±0.061) 3.2±0.32）5）常规针刺组 31 0.52±0.03 0.7±0.43）6）空白对照组 31 0.51±0.05 0.61±0.34）

2.2 组织形态学观察 伊红染色结果显示，平衡针刺组治疗组成纤维细胞形态规则，呈梭形，其细胞核为卵圆形，位于细胞中央，数量多。免疫细胞化学结果显示，成纤维细胞表达为阳性；常规针刺组成纤维细胞形态较规则，呈梭形，其细胞核为卵圆形，位于细胞中央，数量一般，成纤维细胞表达为阳性；空白对照组成纤维细胞形态不规则，其细胞核为卵圆形，位于细胞一侧，数量较少，成纤维细胞表达为弱阳性。

2.3 成纤维细胞增殖指数 0～6 d各组增殖较缓慢，3组细胞的生长曲线均呈平缓上升趋势；7～9 d细胞的增殖速度加快，从9 d开始平衡针刺组 (系列1）的增殖速度明显高于常规针刺组（系列2）与空白对照组（系列3），第21天，3组增殖速度达到峰值，平衡针刺组的增殖速度明显高于其他2组。见图1。

图1 成纤维细胞增殖指数

3 讨论

踝关节扭伤属中医学“筋痹”“痹症”范畴，是由于外伤因素，使踝部的经脉受损，气血运行不畅，经络不通，气滞血瘀而致[2]。制定便捷、合理、高效的治疗方案是未来的研究趋势，最大限度恢复运动功能、降低并发症发生率是未来研究的最终目标[3]。其主要表现为踝关节肿胀、疼痛，局部瘀斑和功能障碍等，如处理不及时或不当，常常遗留踝关节不稳及后期创伤性关节炎。针刺治疗软组织损伤可提高痛阈，减轻局部炎症反应，促进组织修复，从而起到缓解疼痛、减轻肿胀的作用[4-5]。目前有腧穴与脑功能特定联系、针灸镇痛机制[6]等方面相关研究的报道。

根据《灵枢·官针》：“巨刺者，左取右，右取左”，《灵枢·终始》：“病在下者，高取之”，故独取健侧大陵穴。大陵穴，是临床上常用的特定穴，属手厥阴心包经，为手厥阴心包经之输穴、原穴。大陵穴位于腕掌侧横纹头之中点，桡侧腕屈肌腱与掌长肌之间的凹陷处，为手厥阴心包经之原穴，因其在五输穴中为输穴，属土，据其“输”主体重节痛的理论，此穴还具有理气止痛、舒筋活络、祛风止痹的作用。大陵是心包经的输穴、原穴，与三焦经相表里，在王文远教授的平衡穴位里称为踝痛穴，能治疗小腿、踝关节及足底疼痛等病变；在名医李柏松先生的“八字治疗法”中大陵穴为治疗踝关节疼痛的反应点。在治疗方面临床取用原穴能使三焦原气通达，从而激发原气，调动体内的正气以抗御病邪，有研究[7]认为针刺大陵穴能促进血管舒张，故巨刺大陵穴可行气活血、化瘀通络、消肿止痛。研究表明[8]：针刺大陵穴则可能更倾向于对自主神经及客观语言等非主观因素产生影响。

“平衡针刺法”是在继承传统医学的基础上，吸收现代科学理论而发展起来的一门现代针灸学。平衡针刺采取远距离取穴，即“病在上，取之下；病在下，取之上；病在左，取之右；病在右，取之左”；突出单穴疗法，原则上是一病一穴，一症一穴；突出快速针刺亦称三快针法，即进针快、找针感快、出针快，整个针刺过程控制在3 s之内；突出即时效应亦称一针见效。平衡针刺具有取穴少、疗效好、安全价廉，突出安全、突出有效、突出简便、价格低廉等特点，充分地发挥了机体自身调节平衡的独立性，同时产生异向思维，采用头痛医脚，脚痛医手的平衡取穴方法。涂国卿[9]采用“整体平衡疗法” (平衡针刺法加平衡推拿法)治疗腰椎间盘突出症，并与常规针刺和推拿方法对比，观察两者镇痛效果与镇痛时效，表明“整体平衡疗法”对比传统针刺和推拿疗法治疗腰椎间盘突出症具有更好的镇痛效果，体现了中医整体观的优越性。韩笑[10]采取平衡针腰痛穴对比传统针刺治疗腰椎间盘突出症，结果：2组治疗后比较，疼痛改善率及疼痛分级指数总分、视觉模拟量表评分、现时疼痛状况，平衡针组略显优势，既体现在即时效果，也表现在远期疗效方面 (P<0.05)。结论：平衡针能很好地改善腰椎间盘突出症的疼痛症状，既有即时效果，也有远期疗效。

成纤维细胞 (fibroblast，FB)是主要的软组织损伤修复细胞，它是高度异型的间充质细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，也是致密结缔组织如肌腱、韧带分泌胶原的主要细胞。成纤维细胞可以分泌多种生长因子 (如TGF-b， PDGF， bFGF)、激素 (如IGF-I，IGF-II)及细胞素(如IL-1，TNF-a）。成纤维细胞能够维持各种生长因子、细胞素、基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子的合成与分解平衡。因此Lekic等[11]认为，它是创伤修复的工程师、建筑者和管理员。了解与控制FB的生物学行为是促进软组织损伤修复、创伤愈合、预防瘢痕形成的基础与关键[12]。FB在软组织损伤修复过程中的作用是极为重要的。它的增殖及凋亡将影响着各种生长因子及基质的合成及释放，影响着肉芽组织及瘢痕粘连的形成。在组织损伤修复的不同时期，FB的增殖与凋亡都有不同的意义[13]。关于FB对软组织损伤修复中作用的研究日益深入，但人多数是关于皮肤创伤修复的研究，从FB对肌肉、肌腿、韧带、筋膜等组织的损伤修复角度研究的却不多，但FB在这些组织损伤中的修复过程及机制是基本一致的。

本研究显示：治疗前后各组组织学评分比较，平衡针刺组有显著性差异，常规针刺组有显著性差异，空白对照组没有显著性差异；治疗后各组比较，平衡针刺组与常规针刺组及空白对照组比较都有显著性差异；平衡针刺组治疗组成纤维细胞形态规则，呈梭形，其细胞核为卵圆形，位于细胞中央，数量最多。成纤维细胞表达为阳性，治疗结束后3组成纤维细胞增殖速度达到峰值，平衡针刺组的增殖速度明显高于其他2组。说明平衡针刺能较好地调节成纤维细胞的表达，增加其数量，能更好地修复损失组织，达到较好的治疗效果。