甘蔗渣中水溶性多糖的提取工艺优化

吴金松，马志伟，陈光静，陈晓培，刘俊桃，张荷丽*

(1.河南牧业经济学院，郑州 450046；2.西南大学 食品科学学院，重庆 400715)

甘蔗(Saccharumofficinarum)属草本植物禾本科，有薯蔗、糖秆、甜棒儿等别称，甘蔗秆直立高3～5 m，根状茎粗壮发达且多汁，是一年生或多年生的草本植物，普遍分布在热带和亚热带地域，在我国主要分布在两广、贵州等地区[1]。甘蔗中富含多种糖类、蛋白质、维生素(B1,B2,B6)、蔗脂、钙、磷、铁、植物甾醇、氨基酸等营养成分[2]。由于甘蔗是生产食糖的主要原料，每年的制糖工业会产生大量的甘蔗废渣，如处理不当不但会引起资源浪费，同时也会造成环境污染[3]。甘蔗渣中富含纤维素、半纤维素、木质素以及多糖酚类等活性成分，其目前用途主要在燃料、造纸工业、木材、糖发酵、饲料、微生物培养基等方面，而关于甘蔗渣中活性多糖的提取纯化、活性研究报道较少[4-9]。赵毅[10]发现从甘蔗渣中以及制糖中提取出的糖蜜内，含有对小鼠艾氏癌和肉瘤-180有抑制作用的活性多糖物质。因此，探究甘蔗渣中的水溶性多糖提取工艺对于甘蔗渣资源的再利用具有重要意义。

活性多糖的分离提取工艺通常包括酸碱水解法、溶剂提取法、酶解法以及物理强化辅助提取法(超声波、微波辅助提取)等[11-13]。肖亚聪等[14]通过比较不同的甘蔗渣多糖提取工艺，综合分析对比得出酶解法比水提法的得率高，并且提取时间短，但是酶法辅助提取会引入蛋白酶等杂质，不利于后续的分离纯化；陈兴兴等[15]通过超声波提取法对甘蔗渣多糖的提取工艺进行研究，采用正交试验优化提取工艺，超声波辅助提取法的原理是根据超声波在液体中产生的空化效应，从而加快植物细胞中有效成分的溶出，但是极易造成甘蔗渣大分子多糖结构的破坏。本文采用水提醇沉法提取甘蔗渣中水溶性粗多糖，首先探究了不同单因素(例如提取温度、提取时间、水料比、乙醇终浓度等)对多糖提取率的影响，结合正交试验优化，确定甘蔗渣水溶性粗多糖较佳的提取工艺条件，为工业化提取甘蔗渣多糖在功能食品、药品等领域的应用开发提供理论依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

紫皮甘蔗 郑州市中牟万邦果蔬批发市场；无水乙醇 新乡市三伟消毒制剂有限公司；葡萄糖标品 天津基准化学试剂有限公司；硫酸 洛阳昊华化学试剂有限公司；苯酚 天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA3204B分析天平(感量0.0001 g) 上海精科天美科学仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；101-1型电热恒温鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司； BJ-150多功能粉碎机 德清拜杰电器有限公司；Hanon i2可见光分光光度计 济南海能仪器股份有限公司；TU-1901双光束紫外可见光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甘蔗渣水溶性粗多糖提取工艺流程

1.3.1.1 去皮、榨汁(收集甘蔗渣)、烘干、粉碎、过筛

先将新鲜的紫皮甘蔗 刮去外皮(留皮会影响粉碎效果)，然后除去甘蔗汁，收集的甘蔗渣经漂烫后放入干燥箱中60 ℃烘干，再用粉碎机将其粉碎，并过60目筛后，放置于密封袋中常温保存备用。

1.3.1.2 水提

将称好的甘蔗渣粉放入不同料液比蒸馏水的烧杯中，放入恒温水浴锅中，在设定不同温度和时间的提取条件下浸提，提取过程要用玻璃棒不断进行搅拌，避免甘蔗渣粉粘黏烧杯壁而影响浸提效果。

1.3.1.3 离心分离(或抽滤分离)

水提完成后，将其从水浴锅中取出冷却后分离上清液与沉淀。再以同样的水提条件将沉淀重复浸提，过滤后丢弃沉淀物，将2次的上清液归并在一起。

1.3.1.4 上清液浓缩

用旋转蒸发仪(转速90 r/min，极限真空度0.1 MPa，55 ℃)或蒸馏装置蒸馏浓缩，将上清液浓缩至剩余10～20 mL。

1.3.1.5 醇沉

将浓缩后的提取液缓慢加入，与一定比例4 ℃的无水乙醇混合(形成不同的乙醇终浓度)，然后放置于4 ℃的冰箱中静止12 h左右，会有白色物质从溶液中沉淀出来，将沉淀物与上清液抽滤分离，收集沉淀，将沉淀物置于60 ℃的恒温干燥箱中干燥。

1.3.2 甘蔗渣粗多糖不同提取条件的单因素试验

参考相关文献[16,17]，最终采用水提醇沉法，影响甘蔗渣粗多糖提取的主要因素有提取时间、提取温度、料液比、提取次数和乙醇醇沉浓度等。本试验以料液比、乙醇醇沉终浓度(%)、提取温度(℃)和提取时间(h)为单因素条件，探究其对甘蔗渣粗多糖提取率的影响。

1.3.2.1 不同提取时间(h)对甘蔗渣中粗多糖提取率的影响

称取 5 g 甘蔗渣粉，固定料液比1∶30→在80 ℃的恒温水浴锅中分别浸提1,2,3,4,5 h(各水提2次)→真空抽滤出上清液→归并2次抽滤的上清液→将上清液浓缩→再以70%的乙醇终浓度沉淀12 h→最后测定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.2 不同料液比对甘蔗渣中粗多糖提取率的影响

称取5 g甘蔗渣粉，选取不同的料液比(分别为1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50)→在80 ℃的恒温水浴锅中提取2 h(各水提2次)，后续试验方法同1.3.2.1。

1.3.2.3 不同提取温度对甘蔗渣中粗多糖提取率的影响

称取5 g甘蔗渣粉→固定料液比为1∶30→在不同提取温度(分别为60,70,80,90,100 ℃)的恒温水浴锅中提取2 h(各水提2次)，后续试验方法同1.3.2.1。

1.3.2.4 不同乙醇终浓度对甘蔗渣中粗多糖提取率的影响

称取5 g甘蔗渣粉→固定料液比为1∶30、提取温度设定为80 ℃、提取时间为2 h(各水提2次)→真空抽滤上清液→归并2次抽滤的上清液→浓缩上清液→选取乙醇终浓度分别为50%,60%,70%,80%,90%进行沉淀，静置12 h→最后测定粗多糖的提取率。

1.3.3 甘蔗渣中粗多糖提取工艺的正交试验[18]

为了确定从甘蔗渣中提取多糖的最佳工艺条件，综合比较各单因素对甘蔗渣粗多糖提取率影响的试验结果，选定提取次数为2次浸提，以提取温度、提取时间、料液比、乙醇终浓度为正交试验优化的4个单因素，进行以上四因素三水平的正交试验设计L9(34)。试验不同因素水平和具体安排见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor-level table

1.3.4 甘蔗渣粗多糖提取率的测定

1.3.4.1 葡萄糖含量标准曲线的绘制

采用硫酸-苯酚法[19-21],取10 g左右的葡萄糖放置于105 ℃的干燥箱中烘至恒重，干燥器中冷却后准确称量0.100 g，用蒸馏水溶解后定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成葡萄糖储备液(浓度为1.0 mg/mL)，从储备液中精确吸取5 mL于50 mL的棕色容量瓶中，加蒸馏水至定容刻度线，得到浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖供试液。再配制浓度为5%的无水苯酚溶液(用移液管精确移取50 mL苯酚溶液到1000 mL容量瓶中并定容至刻度线，放入棕色瓶中避光保存备用)。备好洁净干燥的试管，用移液管分别准确移取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL的0.1 mg/mL供试液至试管中，按序加入蒸馏水使总体积达到1.0 mL。再加入1 mL 5%的苯酚溶液充分混匀后，迅速加入5 mL的浓硫酸，立即震荡混匀(做3组平行)，静止30 min。以空白试液(1 mL蒸馏水+1 mL苯酚+5 mL浓硫酸)为参比，用可见光光度计于室温下测定490 nm处的吸光值。根据所测溶液的吸光值绘制线性回归方程，再根据标准曲线方程计算出多糖水解液中的总糖含量(μg/mL)。

1.3.4.2 甘蔗渣粗多糖提取率的测定

将抽提低温鼓风干燥过的甘蔗渣粗多糖沉淀物于250 mL容量瓶中用蒸馏水溶解，定容到标线后摇匀。然后用移液管分别精确吸取2 mL溶液，定容至50 mL的容量瓶中倒转晃动，使溶液混合均匀。然后从中量取1 mL甘蔗渣粗多糖溶液，依次加入1 mL的5%苯酚溶液混匀，迅速加入5 mL的浓硫酸，摇匀后静止30 min。以空白试液做参比，用可见光光度计于室温下测定490 nm处的吸光值。参照总糖含量标准曲线绘制方程，将吸光度值代入线性回归方程可计算出甘蔗渣粗多糖的浓度C。甘蔗渣粗多糖提取率的计算公式如下：

式中：C为样品葡萄糖浓度(μg/mL)；V为甘蔗渣多糖溶液总体积(mL)；D为稀释倍数；M为甘蔗粉质量(g)。

1.3.5 甘蔗渣粗多糖的紫外全波段扫描

取干燥后的甘蔗渣粗多糖，配制成0.5 mg/mL的粗多糖溶液，于紫外分光光度计上进行全波段扫描(190～400 nm)[22]。

1.3.6 试验数据分析方法

利用正交优化软件和SPSS 19.0软件进行相关数据的分析与处理，使用Origin 8.7和Excel 2007进行图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 甘蔗渣粗多糖总糖含量标准曲线

按照葡萄糖浓度和测得的吸光度计算出线性回归方程为y=0.0103x-0.0192, R2=0.9996，总糖含量的标准曲线见图1。

图1 甘蔗渣粗多糖标准曲线Fig.1 The standard curve of bagasse polysaccharides

2.2 单因素试验对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

2.2.1 不同提取时间对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图2 不同提取时间对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.2 The effect of different extraction time on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图2可知，随着提取时间不断增加，甘蔗渣粗多糖不断溶解于水中，提取率也随之提高，提取时间在1～5 h内时提取率增加显著，所以为提高提取效率和节约成本，应选定时间为2,3,4 h 3个水平进行正交试验为宜。

2.2.2 不同料液比对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图3 不同料液比对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.3 The effect of different material-liquid ratios on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图3可知，在料液比1∶10～1∶30范围内，甘蔗渣粗多糖的提取率随料液比的增长而逐步增长，且增长趋势十分显著。在料液比增加至1∶30后提取率呈下降趋势，可能是因为当料液比过高时，甘蔗渣中的其他杂质成分也都溶析出来，导致提取率的降低。但是当料液比为1∶10时提取率最低，可能由于在提取溶剂用量较少时，甘蔗渣多糖没有充分溶解，也不利下一步抽滤。此外，料液比例过高时，浸提体系的总体积增加，导致后续浓缩工艺的成本增加，为提高提取工艺效率，选择1∶20,1∶30,1∶40 3个水平的料液比进行后续正交试验。

2.2.3 不同提取温度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图4 不同提取温度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.4 The effect of different extraction temperatures on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图4可知，随着提取温度的不断升高，甘蔗渣粗多糖的提取率呈现出先上升后下降的趋势，在60～80 ℃水提温度下，提取率随温度的上升而增加，水提温度在80 ℃左右时提取率达到最大，但在80～100 ℃时呈下降趋势，可能是因为温度较高引起破壁效应加剧导致多糖分解，进而提取率也随之下降，所以选择提取温度的3个水平70，80，90 ℃进行正交试验为宜。

2.2.4 不同乙醇终浓度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图5 不同乙醇终浓度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.5 The effect of different final ethanol concentration on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图5可知，随着乙醇最终沉淀浓度的不断提升，甘蔗渣粗多糖的提取率不断增加，且增加显著，所以选择乙醇最终沉淀浓度为70%，80%，90%进行后续的正交试验。

2.3 水提醇沉法提取甘蔗渣粗多糖试验结果

正交试验优化甘蔗渣粗多糖的提取工艺试验数据见表2。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，4个单因素对结果的影响程度为B>A>C>D，即影响要素的关系依次排序为乙醇终浓度>料液比>提取温度>提取时间，提取时间的影响不显著，综合提取率和提取效率考虑，得出最优组合为A2B3C1D2，即最佳提取工艺条件为料液比1∶30，乙醇终沉淀浓度90%，水提温度70 ℃，水提时间3 h。在此提取条件下，甘蔗渣粗多糖的提取率为 1.03%。

2.4 甘蔗渣粗多糖的紫外吸收曲线

图6 甘蔗渣粗多糖溶液的紫外扫描图谱Fig.6 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharides solution from bagasse

由图6可知，在波长190～400 nm范围内，甘蔗渣粗多糖溶液经过紫外吸收扫描后， 在260～280 nm 处均无明显的吸收峰，说明其不含或含有极少量的核酸和蛋白质等杂质。

3 结论

通过水提醇沉法，结合单因素试验和正交试验优化，得出甘蔗渣中水溶性多糖的最佳提取工艺条件为：料液比1∶30，乙醇终沉淀浓度90%，水提温度70 ℃，水提时间3 h。在此提取条件下，甘蔗渣粗多糖的提取率为 1.03%。通过对甘蔗渣粗多糖溶液的紫外扫描，在260～280 nm 处均无明显吸收峰，进一步说明了该提取工艺条件的可靠性。提取到的甘蔗渣粗多糖有待于进一步的纯化，为甘蔗渣多糖的活性探究和结构鉴定打下坚实的基础。