天然复合香辛料对低盐四川泡菜内微生物菌系的影响研究

张婷，李晓，许航，唐启贤，贾利蓉,2，段飞霞,2*

(1.四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065；2.四川大学食品科学与技术四川省高校重点实验室，成都 610065)

四川低盐泡菜是以新鲜蔬菜为主要原料，添加(或不添加)香辛料等辅料，用食盐或食盐水泡渍发酵，经拌料(调味)、包装(或不包装)、灭菌(或不灭菌)等加工而成的蔬菜制品[1]。泡菜中的活性乳酸菌能够保护胃肠道、增强免疫力[2]，而传统高盐腌渍生产工艺会对人体健康和环境产生不利影响，因此低盐活性益生菌型健康泡菜成为行业发展趋势。但低盐腌渍不足以抑制有害微生物的生长，从而导致泡菜风味劣变，亚硝酸盐积累，严重时造成泡菜腐败。

天然香辛料是四川泡菜加工过程中的常用辅料，具有抑菌、抗氧化、增香等作用[3-7]。现有研究主要在于香辛料的抑菌作用和机制，对香辛料在低盐泡菜发酵过程中的选择性抑菌作用及其对亚硝酸盐的影响研究较少。本文以辣椒、花椒、大蒜和生姜为研究对象，考察了复合香辛料对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌生长和亚硝酸盐积累的影响，并通过正交实验得出最优配比，对低盐活性益生菌型健康低盐泡菜的生产有一定指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白萝卜、辣椒、花椒、大蒜、生姜：当地(成都)农业公司；食盐：四川久大制盐有限公司；孟加拉红培养基、营养琼脂培养基：北京奥博星有限公司；MRS培养基：杭州微生物试剂有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、盐酸、氨水、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺：成都科隆化学品有限公司；肠膜明串珠菌、植物乳杆菌：四川高福记生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

101型电热恒温鼓风干燥箱、PYX-DHS-X型隔水式电热恒温培养箱、GRP-9160型隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；2XZ-2直联旋片式真空泵 上海沪析实业有限公司；LDZX-50FB型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1C型医用超净工作台 苏净集团安泰公司；pHS-3C型pH计 杭州奥立龙仪器有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；KSK型恒温水浴锅 上海科析试验仪器厂；BSA224S型分析天平 上海新航仪器厂；Eppendorf移液器 德国普兰德公司。

1.3 实验方法

1.3.1 低盐泡菜的制作工艺

低盐泡菜的制作工艺流程图见图1。

图1 低盐泡菜的制作工艺流程图

1.3.1.1 原料预处理

白萝卜洗净、沥干后切分为2 cm×2 cm×2 cm的小块；大蒜去皮、清洗、沥干、切片后备用；辣椒、生姜清洗、沥干、切片后备用；花椒清洗、沥干后备用。

1.3.1.2 接种与发酵

采用预灭菌的盐水与蒸馏水进行低盐泡菜腌渍。盐水和萝卜以2∶1的比例放入广口瓶中，食盐终浓度4%，乳酸菌接种浓度5×103cfu/mL，0.1 mm聚乙烯薄膜封口模拟低盐泡菜实际生产过程中的发酵环境，22 ℃恒温发酵。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1 pH的测定

按照GB 5009.237-2016，用pH计测定低盐泡菜的pH值。

1.3.2.2 亚硝酸盐的测定

按照GB 5009.33-2016，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量。

1.3.2.3 菌落计数

取1 mL发酵液，以1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000梯度稀释后制备稀释液。按照GB 4789.35-2016，用0.1 mL稀释液接入凝固后的MRS琼脂培养基，37 ℃厌氧恒温培养48 h后计数为乳酸菌活菌总数；按照GB 4789.15-2010，用0.1 mL稀释液接入孟加拉红培养基，28 ℃恒温培养5天后计数为酵母菌总数；按照GB 4789.2-2010，用0.1 mL稀释液于80 ℃加热10 min后接入琼脂培养基，37 ℃恒温培养48 h后计数为芽孢菌总数；按照GB 4789.2-2010，用0.1 mL稀释液接入琼脂培养基，37 ℃恒温培养48 h后计数为菌落总数。

1.3.2.4 感官评价方法

采取计分法对各样品的色泽、质地、风味进行感官评定，外观、质地、风味的权重分别为0.3，0.2，0.5[8]。外观评价标准：呈现出萝卜应有的色泽，汤汁清亮，无浮膜[9]，总分100分；质地评价标准：萝卜有弹性，咀嚼时口感脆嫩，总分100分；风味评价标准：酸爽可口，香味浓郁，总分100分。综合评分高于80分，则认为样品对整体感官品质的影响在可接受范围内，其浓度范围可用于后续正交实验。

1.3.3 单因素实验及正交实验

按照图1所示工艺，在低盐泡菜发酵至pH 3.5后加入天然香辛料，24 h后检测低盐泡菜中乳酸菌、芽孢菌、酵母菌的菌落总数，并与未加天然香辛料的低盐泡菜做对比。再依据单个香辛料单独作用的实验结果，采取 L9(34)的正交实验方案研究香辛料影响四川低盐泡菜发酵过程中乳酸菌和其他微生物生长的协同作用，在此基础上形成香辛料复配的最佳条件，并评价该条件下低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌的消长情况、pH变化趋势和亚硝酸盐积累以及低盐泡菜样品的感官品质。

2 结果与分析

2.1 单一香辛料对低盐泡菜中微生物生长和感官品质的影响

2.1.1 辣椒对低盐泡菜中微生物生长和感官品质的影响

表1 辣椒对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品质的影响

由表1可知，辣椒抑菌效果显著，辣椒添加量为1.2 g/dL时，对芽孢菌的抑制率大于90%，对酵母菌的抑菌率为85%；当辣椒添加量为2.4 g/dL时，对芽孢菌和酵母菌的抑菌率均大于90%；当辣椒添加量超过4.8 g/dL时，辣味过重，导致低盐泡菜香气被掩蔽，色泽变暗，整体感官评分低于80分。结合感官评价和抑菌实验结果，辣椒添加量在 2.4～4.8 g/dL时，具有较好的抑菌作用，且对低盐泡菜感官品质无明显不良影响。

2.1.2 大蒜对低盐泡菜中微生物生长和感官品质的影响

表2 大蒜对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品质的影响

由表2可知，低盐泡菜中，大蒜添加量达到6.0 g/dL时，对酵母菌和芽孢菌生长的抑制率均在90%以上。当大蒜添加量达到12.0 g/dL时，整体呈现出浓郁的腌渍大蒜风味，感官综合评分低于80分。因此，结合感官评价和抑菌实验结果，认为大蒜的适宜添加范围为 6.0～10.0 g/dL。

2.1.3 花椒对低盐泡菜中微生物生长和感官品质的影响

表3 花椒对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品质的影响

由表3可知，花椒对芽孢菌和酵母菌均有抑制作用，且对芽孢菌的抑制效果优于酵母菌。花椒添加量达到1.8 g/dL时，对芽孢菌的抑制率达95%，对酵母菌的抑制率仅为64.9%；当花椒用量增加到3.0 g/dL时，对酵母菌的抑制率仅为66.3%。花椒对低盐泡菜的风味和色泽有较大的影响。当花椒添加量为2.4 g/dL时，低盐泡菜产生令人不适的麻味，发酵液和萝卜块的色泽变为褐色，感官评分低于80分。结合感官评价和抑菌实验结果，认为花椒单独作用时应该选择添加量为0.6～1.8 g/dL。

2.1.4 生姜对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌菌落数和感官品质的影响

表4 生姜对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品质的影响

由表4可知，生姜对低盐泡菜中酵母菌、芽孢菌生长的抑制能力较弱。生姜添加量为12.0 g/dL时，对芽孢菌的抑制率仅为52%，而此浓度下低盐泡菜已呈现出明显的涩味，感官综合评分低于80分。因此，结合抑菌实验和感官评价结果，生姜的适宜添加量为6.0～10.0 g/dL。

综上所述，4种香辛料，辣椒、大蒜、花椒、生姜对四川低盐泡菜发酵过程中酵母菌、芽孢菌的生长均具有不同程度的抑制作用，其对芽孢菌的抑菌能力大小为：辣椒>大蒜>花椒>生姜；对酵母菌的抑菌能力大小为：辣椒>大蒜>生姜>花椒。4种香辛料单独作用时，对乳酸菌的生长均没有明显的抑制作用，辣椒对乳酸菌的生长有微弱的促进作用。

添加量较高时，4种香辛料对低盐泡菜的感官品质均有不同程度的影响，主要表现在：其特征性风味过于突出，掩蔽低盐泡菜原有的香气和滋味，并对低盐泡菜的色泽产生不利影响。因此，香辛料对低盐泡菜感官品质的影响限制了其单独使用时的浓度范围，因此单一香辛料单独作用难以抑制低盐泡菜中有害菌的生长。为同时实现对低盐泡菜中有害菌的抑制和感官品质的提升，有必要对以上香辛料进行复配。

选择低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌的生长状况作为测定指标，采用正交实验对4种香辛料：辣椒(2.4～4.8 g/dL)、大蒜(6.0～10.0 g/dL)、花椒(0.6～1.8 g/dL)、生姜(6.0～10.0 g/dL)的复配方案进行优化。

2.2 复合香辛料对低盐泡菜中微生物生长和感官品质的影响

正交实验中，不同配比的复合香辛料对低盐泡菜中微生物生长和感官品质的影响见表5。

表5 复合香辛料对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品质的影响

由极差分析可知，对低盐泡菜中酵母菌生长影响最大的因素为辣椒添加量，酵母菌抑制率随辣椒添加量上升而增大；对芽孢菌生长影响最大的因素为花椒添加量，其后依次为辣椒、生姜和大蒜。当复配比例为辣椒3.6 g/dL、大蒜8 g/dL、花椒1.8 g/dL、生姜6 g/dL时，复合香辛料对低盐泡菜中芽孢菌和酵母菌的抑菌率均达98%以上，低盐泡菜乳酸菌数为2.0×108cfu/mL，感官综合评分为90分，低盐泡菜液澄清，香气浓郁，口感脆嫩，该复配比例为最佳配比。

2.3 最优配比下的复合香辛料对低盐泡菜中乳酸菌、pH和亚硝酸盐积累的影响

按正交实验最佳配比将4种香辛料复配后，添加到低盐泡菜中，考察低盐泡菜发酵过程中乳酸菌数量、pH值和亚硝酸盐的积累情况，实验结果见图2。

图2 复合香辛料对低盐泡菜发酵过程中乳酸菌、pH值和亚硝酸盐积累的影响

由图2可知，对照组中乳酸菌在发酵第1天为7.12 log cfu/mL，乳酸菌数随发酵时间延长而增加，第4天达到峰值7.65 log cfu/mL后有缓慢下降，第7天乳酸菌活菌数为7.01 log cfu/mL。对照组pH值随发酵时间降低，第1天为5.1，第4天后降低到3.5以下，第7天达到3.0。对照组中亚硝酸盐的含量随发酵时间延长不断增加，第1天为14.51 mg/kg，第4天已达到20.22 mg/kg(高于GB 2762-2017对亚硝酸盐的限量要求)。

复合香辛料组的乳酸菌生长情况及pH变化情况，与对照组相比无显著差异。复合香辛料组的亚硝酸盐含量变化呈先增加后减少的趋势，在发酵第2天为3.51 mg/kg，第3天达到峰值17.49 mg/kg后快速下降，到发酵第5天降至检测限以下。

泡菜中亚硝酸盐的积累主要与泡菜原料的种类、泡菜液的氧浓度、pH、乳酸菌活菌数和产硝酸盐还原酶的杂菌数量有关。低盐泡菜对照组中，由于缺乏高浓度食盐对微生物生长的抑制作用，酵母菌、芽孢菌等具有硝酸盐还原酶的微生物与乳酸菌共同生长，导致亚硝酸盐快速积累。而添加复合香辛料的低盐泡菜，在发酵前期，由于乳酸菌生长缓慢，pH较高，使得酵母菌、芽孢菌等杂菌的生长繁殖尽管受到复合香辛料的抑制，但数量仍然较高，导致亚硝酸盐积累，达到峰值。在第3天以后，泡菜液环境中氧气消耗殆尽，乳酸菌数量增加，pH下降，含硝酸盐还原酶的杂菌生长被复合香辛料显著抑制，既有的亚硝酸盐在高酸性条件下被化学降解或被乳酸菌还原降解[10-16]，使得其含量下降，直至为0。

3 结论

通过本文的研究发现，低盐泡菜在发酵过程中，失去高浓度食盐形成的高渗透压的抑菌环境，在发酵初期易出现酵母菌、芽孢菌等有害杂菌的快速生长，不仅导致泡菜品质劣变，同时造成亚硝酸盐的大量积累，食用后不利于人体健康。通过单因素和正交实验，优化得到复合天然香辛料抑制低盐泡菜中有害杂菌生长的最优配比(辣椒3.6 g/dL、大蒜8 g/dL、花椒1.8 g/dL、生姜6 g/dL)，在显著抑制低盐泡菜发酵过程中酵母菌、芽孢菌生长的基础上，不降低低盐泡菜中活性乳酸菌数量，且能有效降低成熟低盐泡菜中亚硝酸盐的含量，有望成为低盐四川泡菜生产和制作过程中控制微生物污染和防止亚硝酸盐积累的有效措施。