代谢组学在冠心病痰瘀互结证诊断中的研究进展*

蔡雪朦，王 朔，高 杉，李 琳，李遇伯，于春泉

（天津中医药大学，天津 300193）

《中国心血管病报告2016》的数据显示，冠状动脉粥样硬化性心脏病110万例，占心血管患病人数的第二位。在中国患者过早死亡的原因中，冠心病从1990年的第七位上升至2013年的第三位[1-2]。中医学无冠心病病名，从临床表现看属于“胸痹”、“真心痛”范畴。近年来冠心病诊断的“金标准”仍然是冠状动脉造影术，但因其伴随的一些副作用限制了大规模的人群筛查和早期风险预测。且中医治疗冠心病是以症状、体征、舌脉等一系列证候要素为依据，缺乏客观量化的标准。冠心病中医证候临床流调显示，与痰、瘀相关的证候最为多见，痰瘀互结证已成为冠心病的常见证候[3]。代谢组学方法可以实现疾病与证候的精准诊断，它强调把人作为一个整体来研究，同时在方法学上具有无创伤、动态、接近生理条件等特点，与中医治病整体性和动态性不谋而合。代谢组学已成为一种成功的研究技术广泛应用于众多医学相关领域，如疾病诊断、药效作用机制、药物毒理学等。笔者对其近年来在冠心病早期诊断和痰瘀互结证研究方面取得的进展进行综述，籍以为冠心病痰瘀互结证的诊断提供客观指标，为临床治疗冠心病痰瘀互结证提供疗效评价依据。

1 代谢组学在冠心病诊断中的研究

冠心病诊断的生物标志物范围广，涉及磷脂代谢、能量代谢、脂肪酸分解、肠道微生物代谢物等。

1.1 磷脂代谢 磷脂代谢是冠心病生物标志物研究的热点之一，其中溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPE）和鞘氨醇可作为冠心病诊断的标志物。LysoPC又称溶血卵磷脂，被认为是促炎和致动脉粥样硬化的代谢产物，其水平升高可诱导内皮细胞产生氧化应激，导致心血管疾病[4]；但LysoPC有助于抑制巨噬细胞的合成，阻止巨噬细胞泡沫化，减少胆固醇积累和动脉粥样硬化[5]，Stegemann C等[6]也发现LysoPC和冠心病之间存在负相关。有文献报道显示LysoPC可以根据细胞类型或氧化、炎症状态从而发挥促或抗动脉粥样硬化的作用[7]。Ju YP等[8]研究表明在冠心病心绞痛和心肌梗死患者的血清代谢物中，含有不饱和脂肪酸和游离脂肪酸的LysoPC和lysoPE与冠心病风险增加相关，而含有饱和脂肪酸的lysoPC与冠心病风险降低相关。Gao X等[9]代谢组学分析显示，与对照组相比，冠脉疾病患者植物鞘氨醇显著上调。鞘氨醇的积累是由鞘磷脂酶水解鞘脂的作用引起的，鞘脂具有降低甘油三酯和胆固醇水平的能力，然而患者血浆样品中鞘氨醇的浓度较高，表明鞘脂被耗尽从而增加了冠心病的风险。同样地，在心肌缺血大鼠模型中鞘氨醇也显示出增高的趋势[10]。

1.2 能量代谢 三羧酸循环（TCA循环）和脂肪酸的β氧化是冠心病患者体内的主要能量来源，肉碱类物质和丙酮类物质可作为冠心病诊断的标志物。脂肪酸活化成脂酰CoA，小于10个碳的脂酰CoA容易穿过线粒体内膜进行氧化反应，大于10个碳的脂肪酸分子则需要肉碱的参与，肉碱的功能是将长链脂肪酸转运到线粒体中进行β氧化以获得大部分能量。Li Y等[11]鉴定出与冠心病关联性极强的肉毒碱在冠心病组中显著增加。Laborde CM等[12]对非ST段抬高的ACS患者的血样和尿样进行代谢组学分析，发现患者3-羟基丁酸水平较高。3-羟基丁酸与乙酰乙酸盐、丙酮共同组成酮体，血、尿中酮体水平升高说明脂肪分解代谢产生的ATP作为冠心病患者体内的能量来源，推测其可能是由于缺氧导致的TCA循环受抑导致的，TCA产能降低“促使”这些细胞利用脂肪作为能量来源。这与Kang SM等[13]对HF患者代谢谱的研究结果一致：丙酮，乙酰乙酸的尿排泄增加，TCA循环中间体柠檬酸盐，琥珀酸盐等代谢物的尿排泄减少。

1.3 不饱和脂肪酸及其代谢物 不饱和脂肪酸中ω-3多不饱和脂肪酸、ω-6多不饱和脂肪酸、代谢产物EET以及含有不饱和脂肪酸的磷脂过氧化物可作为冠心病诊断的标志物。

多不饱和脂肪酸（PUFA）是一类保健型油脂，包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、亚油酸（LA）、花生四烯酸（AA）等，其中与鱼油相关的DHA和EPA属于ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFA），有降胆固醇、减肥及抗动脉硬化等作用。研究发现，EPA等ω-3PUFA可减少白细胞的内皮相互作用，抑制炎症刺激物的产生，可通过抑制核因子NF-κB活性直接下调炎症基因，并和PPARs通路的激活有关[14]。除ω-3PUFA外，近年来坚果和油类（例如红花和玉米油）中ω-6 PUFA保护心血管的潜在机制也引起了研究者的关注。Würtz P等[15]对前瞻性队列研究中冠心病患者的代谢物进行分析鉴定发现了较高浓度的ω-6 PUFA与较低的冠心病风险相关，且均通过抗炎机制发挥心脏保护作用。Steffen BT等[16]使用气相色谱和酶联免疫法分别检测血浆ω-6 PUFA浓度以及IL-6、TNF-α、sICAM-1等炎症内皮活化指标，发现ω-6 PUFA有差异性相关：LA和AA与炎症标志物呈负相关；GLA（γ-亚麻酸）和DGLA（二高-γ-亚麻酸）则与炎症和内皮活化标记正相关。而Li等[11]发现重度CHD患者的LA水平升高，且LA水平每增加一倍，CHD风险随之增加6.13倍。

脂肪生成（DNL）是一种内源性途径，即碳水化合物和蛋白质被转化为脂肪酸。为了研究DNL产生的特定脂肪酸，包括棕榈酸、棕榈油酸，7-十六碳烯酸和顺式-异油酸是否影响冠心病，Wu JH等[17]对2890例年龄≥65岁的受试者开展社区前瞻性代谢组学研究，结果显示异油酸和7-十六碳烯酸的循环浓度与冠心病风险增加有关，相比之下，棕榈酸和棕榈油酸与冠心病无明显相关。棕榈酸作为最丰富的饱和脂肪酸（SFA），Li等发现了其摄入量与CHD发展之间存在很强的正相关关系[11]。

AA可被细胞色素CYP2J2酶代谢生成四种环氧二十碳三烯酸（EET）的同源异构体，EET是一种内生性脂质环氧化合物，对心血管有多种保护作用。Oni-Orisan A等[18]的研究表明，阻塞性CAD的存在与较低的循环EET水平相关。EET作为不饱和脂肪酸的代谢产物，强大的抗炎特性可通过抑制NF-κB和IκB激酶的活性阻止白细胞黏附至血管壁，这一作用独立于它的扩血管作用；含有PUFA的磷脂是自由基诱导的脂质过氧化（LPO）的主要靶标，AA和LA被酯化为LDL中的磷脂和胆固醇，随后的氧化产物氧化磷脂（oxPLs）在动脉粥样硬化进程中起着重要的作用，含有PUFA的氧化磷脂成为冠心病的新型生物标志物。Lu J等[19]研究发现含有PUFA的磷脂过氧化物可明显区分冠心病患者和健康人的血浆代谢谱。

1.4 肠道微生物代谢物 近年来，饮食的“代谢过滤器”—肠道微生物成为冠心病研究的热点，它不仅可以作为CHD诊断的潜在标志物，还可以通过调整患者的肠道生态系统来开发新的治疗策略。TMAO已成为动脉粥样硬化疾病的公认标志物。Qiang F[20]等对冠心病患者的血、尿进行代谢组学研究，发现LysoPC和甘油磷酸胆碱可被肠道微生物酶复合物分解形成气体TMA，随后被肝脏黄素单加氧酶（FMO）有效地吸收代谢形成TMAO，从而促进动脉粥样硬化的发生。Wang Z[21]等开展动物实验证明膳食磷脂酰胆碱和其他含TMA的物质（如甜菜碱）可增强小鼠动脉粥样硬化病变的发展。此外，Qiang F多次在CHD患者的血浆和尿液中鉴定出甘露醇，Spearman相关分析显示，梭菌属物种HGF2，链球菌属物种M334和链球菌属M143在甘露醇代谢中发挥重要作用，甘露醇已被鉴定为CHD的新型生物标志物。

2 代谢组学在冠心病痰瘀互结证中的研究

据冠心病患者中医证候学特征统计，在34640例冠心病患者中，排在前2位的为：心血瘀阻5 202例，占 15．02%；痰阻心脉 4 671 例，占 13．48%[3]，代谢组学对其中医证型的研究也多集中在这两大证型。

2.1代谢组学在冠心病血瘀证中的研究 活血化瘀法是中医学的重要组成部分，陈可冀院士继承“瘀滞内结之血为血瘀”等理论，赋予冠心病血瘀证内涵，代谢组学的发展则为血瘀证客观化诊断提供了新的分子靶标。史琦等[22]对不稳定心绞痛血瘀证患者的尿液进行代谢组学研究，发现柠檬酸、脯氨酸、异亮氨酸等（具体见表1）可能是血瘀证的特异标志物，主要涉及糖类、氨基酸以及能量代谢紊乱，并存在肝肾损害。血样结果认为含量均升高的肉碱、胆碱、丙酮等是心血瘀阻证患者的代谢产物，存在脂代谢加强、氨基酸代谢紊乱及肾功能损伤[23]。简维雄等[24]检测冠心病患者心血瘀阻证、非心血瘀阻证及对照组的血浆代谢物，得到花生四烯酸、硬脂酸、乳酸等为冠心病心血瘀阻证的血浆代谢标志物，与葡萄糖代谢、脂肪酸代谢紊乱密切相关。同理，对以上受试者的尿液进行全面检测得出结论：葡萄糖、甘油等为冠心病心血瘀阻证的尿液代谢标志物[25]，主要存在脂肪酸分解加快、糖代谢异常和肝肾功能的损坏。郑景辉、陈夏等采用KEGG分析信号通路、HMDB检索相关的酶或转运蛋白联合metPA网络软件将代谢产物路径可视化，得出糖酵解和糖异生、脂肪酸合成通路参与冠心病心血瘀阻证的形成[26]；尿液代谢组结果则主要涉及半乳糖代谢、酮体的合成和降解通路[27]。王勇等[28-30]通过放置Ameriod环制备慢性心肌缺血血瘀证和气虚血瘀证小型猪模型，对两种证型的小型猪血清内源代谢物进行分析，结果发现柠檬酸、肌酸、γ－氨基丁酸等可作为血瘀证的生物标志物，而气虚血瘀证则涉及柠檬酸、硬脂酸、甘油等代谢物。魏星等[31]分析冠心病血瘀证组和非血瘀证组及健康人的血液代谢物，结果显示健康对照组与冠心病患者、血瘀证组和非血瘀证组的血浆代谢物有明显分离趋势，其中胆固醇和木糖醇有望作为冠心病血瘀证的生物标志物。华何与等人[32]对冠心病心绞痛心血瘀阻、气滞血瘀、气虚血瘀三种血瘀证患者的血浆进行代谢组学分析，1HNMR代谢谱差异能在一定程度上区分气虚血瘀证与其他血瘀证，柠檬酸、3-羟基丁酸、丙酮等代谢物含量降低，可作为气虚血瘀证的生物标志物。黄亚丽[33]总结了冠心病血瘀证与健康人样本的可能差异代谢物共40个，代谢物主要集中在氨基酸、脂肪酸，涉及代谢通路主要包括能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和脂质代谢。

2.2 代谢组学在冠心病痰浊证中的研究 2017年8月，中国中医科学院病证研究中心的胡镜清研究员在首届中医痰瘀互结证基础与临床学术研讨会上发布了《冠状动脉粥样硬化性心脏病痰湿证临床诊断标准》[34]。除了血脂、CRP、Hcy等指标，笔者试图寻找新型生物标志物作为冠心病痰浊证诊断的依据。张红栓等[35]对冠心病痰浊证、血瘀证患者的血浆进行研究，结果显示低密度和极低密度脂蛋白、酮体、葡萄糖等含量均高于血瘀证组，表明痰浊证存在更严重的脂代谢和糖代谢紊乱，这与杜武勋等的研究结果相一致[36]。尿样代谢组学结果显示[37]，α-酮戊二酸、顺式-乌头酸、柠檬酸等为冠心病痰浊证的生物标志物，表明冠心病痰浊证与TCA循环、脂肪酸代谢等密切相关。陈浩等[38]检测健康组、气虚血瘀证组和气虚血瘀痰浊证组的血、尿内源性代谢物，结果显示马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯这四种物质有可能成为痰浊证的生物标志物。鹿小燕等[39]比较痰浊证和血瘀证患者的血清代谢组学，结果发现两组差异代谢物主要有苹果酸、葡萄糖、甘氨酸以及不饱和脂肪酸等，其中ω-3PUFA系在痰浊组中降低，表明痰浊组具有更高的血脂水平和血液黏稠度。程鹏等[40]测定痰凝心脉证、心气虚弱证的冠心病患者血清内源性代谢物，分析显示痰浊证丝氨酸、缬氨酸、2-羟基丙酸等显著高于气虚证组。Zhao L等[41]基于UPLC-Q-TOF/MS和多变量统计分析将健康者与冠心病痰证和瘀证患者的基础代谢物主要区别开来，主要涉及花生四烯酸代谢，氨基酸代谢和能量代谢等，其中17，20-二甲基前列腺素F1α、PGH 2-EA等可能成为痰浊证的生物标志物。

综上所述，冠心病血瘀证主要涉及葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、TCA、氨基酸代谢、能量代谢、酮体的合成和降解以及肝肾功能的损害；痰浊证则存在更严重的脂代谢和糖代谢紊乱。尽管现如今对冠心病痰瘀互结证的代谢组学研究尚不完善，但从病因学的角度不难推测冠心病痰瘀互结证的代谢组学与糖脂代谢、能量代谢等相关。

表1 冠心病痰、瘀证的主要代谢标志物研究

3 展望

代谢组学技术已成功应用于冠心病研究领域，为冠心病的临床诊断提供新的方法。但代谢组学研究的对象是体内代谢物，这就容易受性别、年龄、饮食等环境因素的干扰，这些变化都会对结果的分析带来困难。需要注意的是待测样品的稳定性、取样至冷冻之间的时间里也可能会改变待测样品的代谢物谱。因此，扩大临床试验的样本量及匹配分析,必要时进行随机双盲对照重复试验、验证结果。