液液萃取结合GC-O和GC-MS解析镇江香醋香气成分

袁源，范文来，徐岩

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学 生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)

镇江香醋是我国传统发酵产品，以优质糯米为原料，采用传统复式糖化、酒精发酵和醋酸固态分层发酵工艺，最后经陈酿而成，具有“色、香、酸、浓”的特点，以其浓郁的香气而著称于国内外，深受广大消费者喜爱[1]。

为剖析镇江香醋的香气成分，较多的研究采用顶空-固相微萃取(head-space solid phase microextraction，HS-SPME)的方法。2007年通过HS-SPME与气相色谱-闻香法(gas chromatography-olfactory，GC-O)联用技术建立了镇江香醋的香气指纹图谱[2]；2010年，应用同样方法，初步得出乙酸、3-甲基丁酸、乙酸乙酯等16种物质为镇江香醋的特征香气物质[3]；2017年，研究人员[4]利用HS-SPME结合全二维飞行时间质谱(GC×GC-TOF-MS)在镇江香醋中共检测出360种挥发性物质，通过GC-O得出3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、3-(甲硫基)丙醛等13种物质为重要香气物质。此外，也有研究人员采用同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)研究镇江香醋[5]，共检测出32种香气成分，并发现醋酸、吡啶、四甲基肼等物质在镇江香醋中的含量较高。

然而，国外食醋风味物质研究多采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)[6-8]结合溶剂辅助风味蒸发(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)的前处理方法。SAFE主要是去除萃取物中的色素、蛋白质和脂肪[9]，与HS-SPME技术相比，液液萃取技术处理的样本量更大，更易于获得一些含量微小，但可能对风味影响更大的化合物[10]。

本研究采用LLE结合SAFE的前处理方法，并将镇江香醋中香气化合物按酸碱性进行分离，以减少色谱峰重叠。应用香气稀释萃取法(aroma extract dilution analysis，AEDA)对镇江香醋进行研究，以期发现更多的香气物质。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

样品：江苏恒顺醋业股份有限公司生产的恒顺金梅牌镇江香醋，于2017年9月12日购买自当地超市。

试剂：表1，表2中标有RI 的化合物标准品：色谱纯，购于Sigma-Aldrich(上海)公司；乙醚、NaCl、无水Na2SO4、H2SO4、NaOH：分析纯，购于中国医药(集团)上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

GC 6890 N 气相色谱和5975 MSD 质谱仪,美国Agilent公司；ODP2 闻香仪,德国Gerstel公司；SAFE装置,德国GlasblasereiBahr公司；Avanyi J-E高速离心机,美国Beckman公司；N-EVAP111型氮吹仪,美国Organomation公司；Milli-Q 超纯水系统,美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 LLE方法

食醋LLE会产生严重乳化现象。参考LANGOS等人[11]修改后的方法，配制质量浓度为172 g/L的K4[Fe(CN)6]·3H2O溶液，以及质量浓度534 g/L的ZnSO4·H2O溶液，各取20 mL，先后加入200 mL醋样中，搅拌均匀后静置30 min，沉淀蛋白等物质后，于4 000 r/min离心5 min，收集上清液。上清液加NaCl饱和，用120 mL重蒸乙醚萃取3次，收集萃取相(包括乳化层)，称作“萃取液1”。

1.3.2 SAFE

根据参考文献[12]，设置恒温水槽温度50 ℃，在冷阱和杜瓦瓶中加入液氮，打开真空泵，待系统压力降至10-3Pa并稳定后，将“萃取液1”倒入滴液漏斗中，开始样品SAFE。完成后取下接收瓶。待瓶内液体自然融化后，将瓶内液体用无水Na2SO4于-20 ℃干燥过夜，得到无色清亮萃取液，称作“萃取液2”。

1.3.3 分馏

参照FAN等人方法[13]，将“萃取液2”置于分液漏斗中，加入100 mL煮沸后冷却的超纯水，加NaCl饱和，用10 mol/L NaOH溶液将pH调至9，收集有机相，此为“中-碱性组分”。将水相用5 mol/L H2SO4溶液调pH至2，然后用60 mL乙醚萃取3次(每次20 mL)，收集萃取相，即“酸性-水溶性组分”。将中-碱性组分和酸性-水溶性组分分别用无水Na2SO4于-20 ℃干燥过夜，氮吹至250 μL，分别进行GC-O分析。

1.3.4 GC-O

采用AEDA法[13]，挑选2名经过闻香培训的硕士研究生进行闻香分析。用重蒸乙醚分别将中-碱性组分和酸性-水溶性组分以1∶3，1∶9，1∶27，……的比例依次稀释，每人对每个稀释度闻香分析3次，6次中至少有1次被嗅到则继续稀释，直到不能闻到香气为止。每种物质的FD值为无法嗅到其香气的最高稀释度。

1.3.5 GC-MS条件

利用DB-FFAP(60 m×0. 25 mm × 0. 25 μm)色谱柱。色谱条件为：进样口温度250 ℃，载气为He气，流速2 mL/min，进样量1 μL，不分流进样，样品随载气一半进入检测器，一半进入闻香装置。升温程序为：50 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min 速率升温至230 ℃，并保持15 min。质谱条件：EI电离源；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；扫描范围：35～350 amu。

1.3.6 化合物定性

根据改进的KOVATS[14]法计算化合物保留指数(RI)。通过与NIST库的标准质谱图比对、RI、香气描述与标准品RI、香气描述比对确认。

2 结果与讨论

应用LLE结合SAFE提取、分离镇江香醋香气化合物，并分为中-碱性和酸性-水溶性组分。应用AEDA共检测到60种香气化合物，包括羰基类5种、酯类3 种、脂肪酸类16种、醇类2种、芳香族类20种、内酯类1种、杂环类10种以及含硫化合物3种；在酸性-水溶性和中-碱性组分中分别检测出37种和27种香气物质。

2.1 酸性-水溶性组分

酸性-水溶性组分中含有大量的脂肪酸、酚类和芳香酸(表1)。

酸类主要贡献醋酸和奶酪香。3-甲基丁酸FD最高(FD=729)，是镇江香醋的最重要香气化合物(表1)；其次，乙酸FD=243，可能是重要香气化合物。3-甲基丁酸由L-亮氨酸经微生物降解产生，乙酸由醋酸菌作用于乙醇生成[15]。此外，新发现6种不饱和烯酸，分别为2-甲基-2-戊烯酸、2-丁烯酸、3,3-二甲基丙烯酸、3-甲基-3-丁烯酸、2-戊烯酸和4-甲基-2-戊烯酸，大多呈现酸、水果、汗臭等气味，但FD值较低，可能对香气有贡献。

在酸性-水溶性组分中共检测到15种芳香族化合物，香兰素的FD值最高(FD=729)，为最重要香气化合物。该化合物呈甜香、香草气味(表1)；其次是2-苯乙酸和愈创木酚的FD值较高(FD=243)，是重要香气化合物，它们分别呈玫瑰花和丁香、烟熏气味。此外，通过GC-O首次在中国食醋中检测到2,6-二甲氧基苯酚、3-苯丙酸、香草酸乙酯、丁香醛、3,4,5-三甲氧基苯酚等芳香族化合物的特征香气，其中2,6-二甲氧基苯酚(FD=81)呈烟熏气味，由木质素在固态发酵阶段降解产生[16]。

在醇类物质中，3-甲基-1-丁醇的FD值相对较高(FD=81)，呈指甲油气味。

表1 镇江香醋酸性-水溶性组分香气化合物的闻香结果Table 1 Aroma-active compounds of Zhenjiang aromatic vinegar in acidic-water soluble fraction detected by AEDA

注：a：RIFFAP，化合物在FFAP 极性柱上的保留指数；RIL，参考文献保留指数；b：MS，化合物通过质谱检测；RI，标准品的保留指数；aroma，化合物通过闻香确认。表2 同。

2.2 中-碱性组分

中-碱性组分主要含有羰基类、酯类、杂环类和芳香族类化合物(表2)。

羰基类化合物中，2,3-丁二酮呈现黄油、奶油气味，FD值较高(FD=243)，是重要香气化合物。此外，呈蘑菇气味的1-辛烯-3-酮、呈麦芽气味的2-甲基丁醛和3-甲基丁醛对总体香气也有一定贡献(FD≥81)。

酯类物质中，乙酸异戊酯和乙酸乙酯的FD值相对较高(FD≥81)，对醋的香气有一定贡献。文献报道乙酸乙酯为雪莉醋的关键香气物质[6]，但在镇江香醋中不是关键香气物质(FD=81)。

杂环类化合物中，2,3,5,6-四甲基吡嗪是最重要香气化合物(FD=729)，呈焙烤、坚果气味。糠醛是重要香气化合物(FD=243)，呈杏仁、甜香气味，大量产生于陈酿过程[15]。

本文共检测到3种含硫化合物，3-(甲硫基)丙醛、3-(甲硫基)-1-丙醇和3-(甲硫基)-1-丙酸。3-(甲硫基)丙醛，呈煮土豆气味，有着最高的FD值(FD=729)，是镇江香醋最重要香气化合物；3-(甲硫基)-1-丙醇也呈煮土豆气味，其FD=243，为重要香气化合物。3-(甲硫基)-1-丙酸呈咸菜气味，存在于酸性-水溶性组分(表1)，是在国内食醋中首次发现的含硫化合物。

3 结论

本研究采用LLE结合SAFE前处理手段，并将萃取液酸性-水溶液组分和中性-碱性组分，利用AEDA检测镇江香醋的香气成分，共检测到60种香气物质，酸类、芳香族类、杂环类和含硫类化合物对镇江香醋的香气贡献较大。基于FD值(FD=729)，镇江香醋最重要的香气物质是3-(甲硫基)丙醛、2,3,5,6-四甲基吡嗪、3-甲基丁酸和香兰素；重要香气化合物(FD=243)是2,3-丁二酮、乙酸、糠醛、3-(甲硫基)-1-丙醇、愈创木酚、2-苯乙酸以及γ-壬内酯。