一种用于细菌酸化成像的电势差响应探针

李小杭,郑年丰,韩守法

(厦门大学化学化工学院,福建 厦门 361005)

细菌的生命活动经常受外界环境变化的影响．在各种环境因素中,酸性是影响细菌生存的不利因素[1]．一些细菌进化后形成了有效的机制来降低苛刻酸性环境的影响，如肠道细菌能够有效地通过极度酸性的胃并引起宿主的肠道感染[2]．据报道,细菌能够通过自我调节使细胞溶质在酸性环境中保持较高的pH[3],有助于它在通过人的胃时能够幸存下来．细菌内部pH对细菌细胞的生长、钙调节、内吞作用、趋药性、细胞黏附等过程有至关重要的影响[4],因此测定细菌内部pH变化对于研究其耐酸性机制、致病机理及预防有害细菌感染等方面具有重要意义．

目前,已有一些方法应用于响应细菌内部pH的变化,如:利用遗传密码的扩张策略将非天然氨基酸整合到特定蛋白,再通过生物正交结合引入一个酸敏感探针以检测肠道细菌周质的pH变化[5]．本课题组通过新陈代谢使D-赖氨酸共轭的酸敏感染料进入到大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的肽聚糖中,用于感应免疫吞噬过程中细菌内部pH的变化[6]．虽然效果明显,但这些方法相对复杂且耗时．对pH敏感的绿色荧光蛋白 (GFP)[7]也被用于细菌内囊泡pH测量,但实际应用时受限于非囊泡区域荧光团嘈杂的背景[8]．而采用31P化学转移的核磁共振(NMR)技术[9]检测细胞pH则需要非常高的细胞浓度,且时间分辨率低,响应时间短,所需设备昂贵[10]．

荧光标记法因其灵敏度高、亮度好、分辨能力高、应用简便等优点而被广泛应用[11],如细胞内pH荧光探针用于细胞、酶、组织活动等方面的研究[12]．但是用于研究细菌与酸性环境作用的pH荧光探针并不多[13],而应用最广的是2,7-二(2-羧基乙基)-5(和6-)-羧基荧光素[14]及其衍生物．不过，该类探针难以定位细菌,易从细胞内泄漏,且其单荧光发射难以用于pH变化的定量分析[15]．

目前将荧光探针引入细菌内的方式多样,其中采用显微镜下注射[16]、高渗溶菌作用[17]、载体介导的内吞作用[18]等方式引入探针会扰乱细胞静息状态的生理机能[19];而利用二乙酸酯的膜渗透作用将探针(如荧光素二乙酸酯[20])引入细胞内部的方式则存在荧光探针容易泄漏到细胞外的问题.一些研究小组采用电穿孔的方式将带负电荷的荧光分子(如8-羟基-1,3,6-芘三磺酸[21])引入细胞内来测定其内部pH,但是由于带负电荷的分子不容易被内部显负电性的细胞吸收而导致效率低下．因此,如果荧光探针分子能以正电荷的形式利用跨膜电势驱动进入细菌细胞内,不但可以提高效率,而且避免了上述的一系列问题．

由于罗丹明及其衍生物具有优良的物理性能,如较长的可见区域、较高的荧光量子产率和较大的吸收系数,使其作为荧光标记物得到广泛应用[11]．细菌结构与哺乳动物细胞的线粒体结构相似[22],具有-180～-140 mV的跨膜负电势,在电场驱动下阳离子亲脂性染料能有效地积聚在线粒体内[23]．因此,带有正电荷的基于酸敏感罗丹明衍生物的荧光探针,有望用于研究细菌与酸性环境之间的相互作用．

本研究设计合成了一个包括起内标作用的香豆素结构单元和带正电荷酸敏感的罗丹明结构单元的电势差响应阳离子探针(CM-RB),对其进行pH滴定、毒性测试并研究其在酸性环境下细菌内部的荧光响应．

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

荧光素和香豆素购自Adams试剂公司;2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-羟基苯并三唑、(±)-2,2′-双-(二苯膦基)-1,1′-联萘(BINAP)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自Alfa Aesa试剂公司;4-二甲氨基吡啶购自西亚试剂公司;5-氨基-1-戊醇、三氟甲磺酸酐(Tf2O)、1-叔丁氧羰基哌嗪、三氟乙酸购自Aldrich试剂公司;乙酸钯和碳酸铯购自百灵威科技公司;吡啶、二氯甲烷、三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、石油醚、甲醇、甲苯购自国药集团化学试剂有限公司;磷酸盐缓冲溶液(PBS)和尼日利亚菌素购自Sigma试剂公司;LB培养基原料购自OXOID公司,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株均购自ATCC公司．除乙腈为色谱纯外,其余试剂均为分析纯．柱层析硅胶(200～300目)购自于黄海化学试剂公司．实验所用水均为超纯水 (18.2 MΩ·cm)．

酶标仪(Spectra Max M5),低分辨质谱(MS)仪(Bruker Dalton Esquire 3000 plus),NMR仪(Bruker AV 500 MHz),激光共聚焦显微镜(Leica SP5),离心机(Beckman Coulter)．

1.2 合成与表征

采用文献[24]中的方法，用1-叔丁氧羰基哌嗪取代荧光素的羟基合成罗丹明衍生物(化合物1)．7-(二乙基氨基)-N-(5-羟基戊基)香豆素-3-甲酰(CM)参考文献[25]中的方法，用5-氨基-1-戊醇与香豆素缩合而得(图1)．

化合物2的合成:称取600 mg化合物1(0.90 mmol) 于25 mL圆底烧瓶中,在氮气保护下用10 mL二氯甲烷溶解并将圆底烧瓶置于冰浴中．然后加入0.62 mL三乙胺(4.48 mmol)碱化,再加入511 mL HATU(1.35 mmol)和22 mg 4-二甲氨基吡啶 (0.18 mmol),搅拌2 min后加入465 mg CM (1.35 mmol)．5 min后将圆底烧瓶从冰浴中取出,继续在室温下搅拌过夜．反应后直接将溶剂减压旋干，过层析柱．先用纯乙酸乙酯为洗脱剂除去杂质,再用V(甲醇)∶V(三乙胺)∶V(二氯甲烷)=5∶1∶94为洗脱剂分离出产物,得805 mg红色固体,产率90%．1H-NMR (500 MHz,CDCl3):δ8.76 (t,J=5.5 Hz,1H),8.64 (s,1H),8.31 (d,J=7.8 Hz,1H),7.81 (t,J=7.4 Hz,1H),7.75 (t,J=7.6 Hz,1H),7.44 (d,J=9.0 Hz,1H),7.32 (d,J=7.2 Hz,1H),7.17 (d,J=9.4 Hz,2H),7.10 (d,J=9.6 Hz,2H),7.05 (s,2H),6.69 (dd,J=8.9,1.6 Hz,1H),6.48 (s,1H),4.01 (t,J=6.2 Hz,2H),3.78 (s,9 H),3.68 (s,9 H),3.48 (q,J=6.9 Hz,4H),3.34～3.30 (m,2H),3.16 (q,J=7.1 Hz,4H),1.48 (s,16H),1.38 (t,J=7.2 Hz,6H),1.25 (dd,J=9.1,5.0 Hz,8H).13C-NMR(126 MHz,CDCl3):δ171.03,164.93,163.07,162.71,160.26,157.96,157.55,156.93,154.36,152.69,147.85,132.98,132.92,131.40,131.12,130.57,130.00,114.96,114.52,110.19,109.65,108.13,97.61,96.27,80.47,65.43,60.28,53.62,46.70,46.31,45.04,39.13,29.02,28.27,28.20,27.90,23.23,20.98,14.14,12.35,8.71.MS (电喷雾模式(ESI)):C57H69N6O10+[M+H+],m/z=997.51(计算值),997.5(测定值).

试剂和条件:a.Tf2O,吡啶;b.BINAP,乙酸钯,碳酸铯,100 ℃,氮气;c.1-羟基苯并三唑,EDC,三乙胺;d.HATU,4-二甲氨基吡啶,三乙胺;e.三氟乙酸,二氯甲烷.图1 荧光探针CM-RB的合成Fig.1 Synthesis of fluorescence probe CM-RB

CM-RB的合成:称取800 mg化合物2(0.80 mmol)于25 mL圆底烧瓶中,加入10 mLV(三氟乙酸)∶V(二氯甲烷)=1∶4的混合溶液溶解,在室温下搅拌反应2 h,反应后直接将溶剂减压旋干，过层析柱．先用V(甲醇)∶V(三乙胺)∶V(二氯甲烷)=5∶1∶94为洗脱剂除去杂质,再用V(甲醇)∶V(三乙胺)∶V(二氯甲烷)=70∶1∶29为洗脱剂分离出产物,得480 mg红色固体,产率75%．1H-NMR (500 MHz,MeOD):δ8.53 (s,1H),8.32 (d,J=7.8 Hz,1H),7.85 (t,J=7.5 Hz,1H),7.80 (t,J=7.7 Hz,1H),7.47 (dd,J=17.5,8.2 Hz,2H),7.35 (d,J=9.3 Hz,4H),7.29 (d,J=9.2 Hz,2H),6.77 (dd,J=9.0,1.5 Hz,1H),6.48 (s,1H),4.10 (d,J=4.6 Hz,8H),3.97 (dd,J=12.2,6.3 Hz,2H),3.56～3.45 (m,12H),3.26 (t,J=6.9 Hz,2H),1.49～1.40 (m,2H),1.40～1.32 (m,2H),1.22 (t,J=7.0 Hz,6H),1.14～1.06(m,2H).13C-NMR(126 MHz,MeOD):δ165.15,163.72,162.57,161.80,158.41,157.62,157.22,153.13,147.69,132.76,131.51,131.25,131.09,130.53,130.21,130.06,115.39,115.17,110.33,108.68,108.03,98.07,95.83,65.13,44.67,43.83,42.67,38.86,28.55,27.64,22.92,11.40.MS (ESI):C47H53N6O6+[M+H+],m/z=797.40(计算值),797.4(测定值).

1.3 CM-RB的pH滴定

将DMF溶解的CM-RB加到Tris-HCl缓冲溶液(pH分别为4.0,4.5,4.7,4.9,5.1,5.3,5.5,5.7,5.9,6.1,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0)与40%(体积分数)甲醇的混合溶液中，配制成10 μmol/L的CM-RB溶液,每个pH梯度配3个相同的样品;再分别采用430和540 nm的光激发CM-RB探针的香豆素和罗丹明结构单元,测定探针的荧光发射光谱．

1.4 CM-RB的毒性测试

在37 ℃下分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌置于LB培养基中生长至600 nm下的光密度(A600)达到0.5左右,离心后用新的LB培养基稀释到A600为0.25左右．各移取3份细菌液至2.0 mL离心管中,分别添加0,50和100 μmol/L的CM-RB(以不添加CM-RB的为对照组,添加50和100 μmol/L CM-RB的为处理组),振荡摇匀,继续在37 ℃下孵育24 h．分别在0,3,6,9,12和24 h测量并记录其A600值．

1.5 CM-RB孵育的细菌在不同pH下的荧光响应

在37 ℃下分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌置于LB培养基中生长至A600达到0.6,然后用新的LB培养基稀释至A600为0.3;接着在37 ℃下添加50 μmol/L CM-RB孵育1 h,然后离心,用LB培养基清洗3次;再分别用100 mmol/L pH 4.0～8.0的PBS稀释,最后用激光共聚焦显微镜成像:分别以543和405 nm的光激发探针,采集罗丹明(550～610 nm)和香豆素(450～510 nm)结构单元的荧光发射光谱．

1.6 尼日利亚菌素对细菌成像的影响

在37 ℃下分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌置于LB培养基中生长至A600达到0.6,再用新的LB培养基稀释至A600为0.3;接着在37 ℃下添加50 μmol/L CM-RB孵育细菌1 h,然后离心,用新的LB培养基清洗3次;然后将每种细菌分为两部分,一部分在37 ℃下进一步用1 μmol/L尼日利亚菌素孵育30 min,然后离心,用LB培养基清洗3次，另一部分不进行该处理(作为对照);再分别用100 mmol/L pH 4.0～6.0的PBS稀释,最后用激光共聚焦显微镜成像．

2 结果与讨论

2.1 CM-RB的设计与合成

为了利用细菌的跨膜负电势驱动进入其内部并产生较好的检测效果,设计了带正电荷的荧光探针CM-RB,它包含了一个香豆素发光团和一个连接哌嗪基团的罗丹明作为酸敏感“开关”;基于文献报道的连接哌嗪基团的罗丹明分子内的pH关联光诱导电子转移(PET)效应[8,26-32](图2(a)),认为带正电荷的CM-RB可以在细菌的跨膜负电势驱动下聚集在细菌内部,并在pH酸化条件下抑制PET效应得到增强红色荧光,用于细菌与酸性环境关联的分析(图2(b))．其创新性在于发展了一种新型的利用正电荷探针靶向活细菌并通过双色法分析细菌内部酸化过程的方法．如图1 所示,以荧光素为起始原料,用1-叔丁氧羰基哌嗪取代荧光素的羟基合成罗丹明衍生物(化合物1)，再与CM缩合后脱除叔丁氧羰基(Boc),得到目标探针CM-RB．相关化合物均通过层析柱分离纯化(纯度98%),所涉及合成步骤产率较高(>75%),产物稳定，可长期保存．

(a) 连接哌嗪基团罗丹明的pH关联PET效应;(b) 带正电荷的CM-RB通过细菌跨膜负电势驱动聚集在细菌内部,酸性条件下通过质子抑制PET效应得到增强的罗丹明荧光.图2 基于电势差驱动、酸性激活的荧光探针CM-RB的细菌酸化成像示意图Fig.2 Schematic diagram of bacterial acidification imaging of fluorescence probe CM-RB based on electric potential difference driving and acid activation

2.2 CM-RB的pH滴定分析

如图3所示,CM-RB的罗丹明和香豆素结构单元的荧光发射峰分别在570和470 nm．在pH 8.0～9.0范围内,罗丹明结构单元的荧光发射峰强度很弱,在pH 5.5～7.5范围内其值随着pH的减小显著上升(图3(a)和(c)),这和图2(a)中描述的质子抑制的PET效应相一致．伴随着酸性条件下罗丹明结构单元信号的显著上升,CM-RB中的香豆素结构单元随着pH的减小则只显示出轻微的波动(图3(b)和(c)),这与设计相吻合．如图3(d)所示,CM-RB的酸敏感反应使得细菌在pH 5.5～7.5范围内能够通过改变探针的比率荧光(即570和470 nm的荧光强度比值I570/I470)进行酸化成像．

(a) pH 4.0～9.0范围内10 μmol/L CM-RB中罗丹明结构单元的荧光发射谱图 (λex=540 nm);(b)pH 4.0～9.0范围内10 μmol/L CM-RB中香豆素结构单元的荧光发射谱图(λex=430 nm);(c)CM-RB的pH滴定曲线;(d)依赖于pH值的罗丹明与香豆素结构单元的荧光强度比．图3 pH关联CM-RB的比率荧光Fig.3 pH mediated ratiometric fluorescence of CM-RB

图4 CM-RB对大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)生长的影响Fig.4 Effect of CM-RB on the growth of E. coli (a) and S. aureus(b)

2.3 CM-RB的毒性分析

为了确定CM-RB对细菌的毒性作用,考察了CM-RB对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌生长的影响,结果如图4所示:随着孵育时间的增长,在0～12 h内,对照组与处理组中大肠杆菌的增长速度基本相同;在12～24 h,对照组与处理组中大肠杆菌的生物量均下降,降幅基本一致,说明CM-RB对大肠杆菌的毒性作用较小．金黄色葡萄球菌在0～9 h内，其对照组与处理组的细菌增长速度基本相同；而在9～24 h,与对照组相比,处理组的增速降低,表明孵育9 h以后CM-RB对金黄色葡萄球菌可能有一定的毒性作用．考虑到实验时间一般不超过9 h,这些结果显示在本研究采用的实验条件下CM-RB的细菌毒性较小．

2.4 酸性环境下细菌内部CM-RB的荧光响应

+图5 在不同pH条件下大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)中CM-RB的荧光响应Fig.5 Fluorescence response of CM-RB in E. coli(a) and S. aureus(b)under different pH conditions

图5所示为不同pH条件下大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中CM-RB的荧光响应,可以看出,在激光共聚焦荧光显微镜中能观察到不同pH下细菌内部较强的香豆素结构单元的蓝色荧光,表明CM-RB有效聚集在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌内部;与香豆素信号相比,罗丹明结构单元的荧光强度随着pH减小逐渐增强．这些结果表明CM-RB能够被活细菌吸收，并且在酸性环境下细菌内部能够显示出双重荧光,可用于双色法分析细菌内部的酸化过程．

2.5 酸性环境下膜通透细菌内部CM-RB的荧光响应

尼日利亚菌素是一种质子载体,它能够破坏细菌膜电位并穿过细菌膜,使得细菌内部和外部环境酸性相同．为了检测在膜电位降低情况下CM-RB是否还留在细菌内,以及细菌膜通透对细菌内部pH变化的影响,用尼日利亚菌素处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌．如图6所示：在不同酸性pH条件下,用尼日利亚菌素处理过的两种细菌内罗丹明结构单元的红色荧光都比对照组的荧光亮度更高,颜色更深；而且清洗之后红色荧光仍然在细菌内部,亮度并未减弱,洗液中也没有发现荧光探针溢出．这些结果表明膜通透后CM-RB荧光探针锚定在细菌细胞内并产生了强烈的酸响应,也间接说明探针进入细菌并非通过膜渗透而是通过电势驱动进入,且该探针能够利用PET效应起到增强荧光的效果．

+表示尼日利亚菌素处理组;-表示对照组.图6 细菌膜通透情况下大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)中CM-RB在不同pH条件下的荧光响应Fig.6 The fluorescence response of CM-RB in E. coli (a) and S. aureus (b) under different pH conditions when the bacterial cell membrane is permeable

由于细菌进化了不同的方法来抵消外部酸性环境的负面影响．如图6所示,膜的低通透性也是细菌抵消外部极端酸性的一种有效方法．因此,增加细菌膜的通透性将有助于提高酸性介质的灭菌效率．这对于日常生活中进行灭菌消毒、预防细菌感染等方面具有重要的启示作用．

3 结 论

细菌和酸性环境之间的相互作用是微生物学研究的一个重要领域．含有内标信号香豆素和酸敏感的罗丹明衍生物组成的电势差响应阳离子探针CM-RB能够有效聚集在细菌内部,并对pH变化产生敏感的比率荧光信号(碱性条件下显蓝色荧光,酸性条件下红色荧光增强)．另外,CM-RB具有亮度高、背景信号少和在水中溶解性好的特点,使其适合分析细菌内部pH变化．本研究提供了一个分析细菌与酸性环境相互作用的简单有效的方法,该方法在研究杀菌剂等方面具有潜在用途．