响应面法优化酶解红松松仁粕制备抗氧化肽

包怡红，王 銮，李 倩，蒋士龙*

（1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江飞鹤乳业有限公司，北京 100015）

有报道证实，抗氧化肽具有抗衰老、抗诱导及抑制肿瘤生长等生物活性[1-2]。而天然抗氧化肽比合成的食品抗氧化剂更加安全可靠，将天然抗氧化肽作为合成抗氧化剂的替代品已越来越引起人们的兴趣。因此，抗氧化肽已不仅在食品工业，而且在医药、化妆品等领域中都广泛受到关注[3]。东北红松松仁粕是松仁经过提油后的副产物，其中蛋白质含量较高，氨基酸组成齐全，是一种优良的抗氧化肽源[4]。选择适当的蛋白酶将其蛋白质进行酶解，可以得到大量的具有各种生理功能的肽类[5]，其不仅具有广泛的活性和多样性，而且能提供人体生长发育所需的营养物质，安全性好、容易吸收[6]。

綦蕾等[7]利用Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶酶解红松松仁制备抗氧化活性肽，其最佳酶解条件中底物质量分数为0.6%。赵玉红等[8]利用Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶酶解红松松仁制备肽，其最佳酶解条件中底物质量分数为6%。所利用的底物浓度相对较低，考虑到生产成本以及前期处理和后期分离浓缩的困难，应尽量提高酶解时的底物浓度[9]。针对这种情况，本试验以松仁粕为原料，酶解高浓度的松仁粕制备抗氧化肽，并对多肽的体外抗氧化活性进行研究，不仅节约了原料、降低了成本，还为红松松仁的资源开发和应用提供基础科学依据和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东北红松松仁粕（蛋白质含量32.48%，脂肪含量38.52%，总糖含量36.14%）：黑龙江省勃利林业局提供；福林酚试剂（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；酸性蛋白酶（80 000 U/g）：上海卡迈舒生物工程有限公司；碱性蛋白酶（100 000 U/g）：邢台市万达生物工程有限公司；中性蛋白酶（50 000 U/g）：济南市和美生物工程有限公司；其他所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-98-1电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；PB-10标准型酸度计：上海精密仪器仪表有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器：常州国华电气有限公司；ALPHAI-2真空冷冻干燥机：德国Christ公司；DHG-9240电热恒温鼓风烘箱：上海恒科有限公司；TGL-16G离心机：上海安亭科学仪器；TDL-5-W台式离心机：湖南星科科学仪器有限公司；RT-6000酶标分析仪：深圳雷杜生命科学仪器有限公司；722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；AT-261电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酶解工艺流程

1.3.2 酶的选择

分别选用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，在相应最佳条件下对6%松仁粕浆料进行酶解，反应结束后，100℃沸水浴15 min灭酶，4 000 r/min离心10 min，以水解液的水解度（degree of hydrolysis，DH）和总还原能力为考察指标，确定最佳酶制剂。

1.3.3 单因素试验

以总还原力、水解度作为评价指标，分别研究酶解pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）、酶解温度（40 ℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶添加量（2 000 U/g、4 000 U/g、6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g松仁粕）、酶解时间（30 min、40 min、50 min、60min、70min、80min、90min、100min）、底物质量分数（5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%）5个因素对松仁粕抗氧化肽酶解工艺的影响。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以酶解温度（A）、酶解pH（B）、酶添加量（C）为影响因素，以总还原力（Y）作为考察指标，进行优化试验，得出制备抗氧化肽的最佳工艺。响应面试验因素与水平见表1。

表1 松仁蛋白粕酶解条件优化响应面试验因素与编码水平Table 1 Factors and coded levels of response surface methodology for pine nut protein meal hydrolysis conditions optimization

1.3.5 测定方法

酶活力：按照参考文献[10]的方法进行测定；水解度：按照参考文献[11]的方法进行测定；总还原力的测定：按照参考文献[12]的方法进行测定。

羟基自由基清除能力：按照参考文献[13]的方法进行测定；2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid），ABTS）自由基清除能力：按照参考文献[14]的方法进行测定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力：按照参考文献[15]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 酶的选择

3种酶在相同酶活力条件下，分别对松仁蛋白粕进行酶解，测定水解液的水解度和总还原力，结果见表2。

表2 不同蛋白酶对松仁蛋白粕酶解的影响Table 2 Effects of different protease on hydrolysis of pine nut protein meal

由表2可知，3种酶中碱性蛋白酶的水解度最高，为23.82%；总还原力吸光度值也最高，为0.57；因此后续试验选择使用碱性蛋白酶。

2.2 东北红松松仁粕酶解制备抗氧化肽的单因素试验

2.2.1 酶解pH对松仁蛋白粕酶解的影响

质量分数为6%的松仁粕浆料，调节温度至55℃，分别调节酶解pH至8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，加入碱性蛋白酶6 000 U/g松仁粕，在恒温磁力搅拌器上反应60 min后，终止酶反应，考察酶解pH对水解度和总还原力的影响，结果见图1。

图1 酶解pH对松仁蛋白粕酶解的影响Fig.1 Effect of enzymolysis pH on hydrolysis of pine nut protein meal

由图1可知，水解度随着酶解pH的升高而增加，在pH值为9.0时达到最大值，之后水解度急剧下降，这是因为酶变性导致活性下降，此时对酶解反应不利。总还原力随酶解pH的升高呈现先上升后下降的趋势，在酶解pH值为9.0时达到最大，吸光度值为0.402。该结果说明，酶解物的水解度高并不代表酶解物的抗氧化能力强。由此可知，酶解物的抗氧化活性与肽的结构氨基酸组成有关[16]，初步确定最佳酶解pH为9.0。

2.2.2 酶解温度对松仁蛋白粕酶解的影响

质量分数为6%的松仁粕浆料，调节pH至9.0，分别调节酶解温度至40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，加入碱性蛋白酶6 000 U/g松仁粕，在恒温磁力搅拌器上反应60 min后，终止酶反应，考察酶解温度对水解度和总还原力的影响，结果见图2。

图2 酶解温度对松仁蛋白粕酶解的影响Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis of pine nut protein meal

由图2可知，水解度随酶解温度的升高而增加，在酶解温度为55℃时达到最大值，继续升高酶解温度，水解度呈下降趋势，可能是因为温度过高酶解作用受到限制。总还原力随酶解温度的升高呈现先上升后下降的趋势，在酶解温度为60℃时达到最大，吸光度值为0.455。初步确定最佳酶解温度为60℃。

2.2.3 酶添加量对松仁蛋白粕酶解的影响

图3 酶添加量对松仁蛋白粕酶解的影响Fig.3 Effects of enzyme addition on hydrolysis of pine nut protein meal

质量分数为6%的松仁粕浆料，调节酶解温度至60℃，pH至9.0，分别加入碱性蛋白酶2000U/g、4000U/g、6000U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g松仁粕，在恒温磁力搅拌器上反应60 min后，终止酶反应，考察酶添加量对水解度和总还原力的影响。

由图3可知，水解度随着酶添加量的增加呈先增加后趋于平缓的趋势，在酶添加量为8000U/g时达到最大值。总还原力随着酶添加量的增加先增大，当酶添加量为8000U/g时达到最大值，吸光度值为0.495，之后逐渐下降。可能是因为水解程度过大，使具有还原能力的肽水解成不具有还原能力的肽或彻底水解成氨基酸。初步确定酶添加量为8000U/g。

2.2.4 酶解时间对松仁蛋白粕酶解的影响

质量分数为6%的松仁粕浆料，调节酶解温度至60℃，pH至9.0，加入碱性蛋白酶8 000 U/g松仁粕，在恒温磁力搅拌器上分别反应30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min后，终止酶反应，考察酶解时间对水解度和总还原力的影响，结果见图4。

图4 酶解时间对松仁蛋白粕酶解的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on hydrolysis of pine nut protein meal

由图4可知，水解度在前50 min增长明显，60 min后增加缓慢，到70 min时趋于平缓，说明酶活力已经下降或酶已经被底物饱和。总还原力前60 min增长明显，从第70 min开始增加缓慢，80 min时吸光度值达到最大值0.604，之后趋于平缓，而当酶解时间延长至100 min时总还原力开始下降，说明随着水解时间变化，得到的酶解物的结构和长度是不同的，其抗氧化活性就可能会不同。蛋白酶将原先具有还原力的肽段被进一步水解成没有还原能力的肽段或者是游离的氨基酸，破坏了抗氧化肽的氨基酸结构序列，而酶解物的氨基酸组成分子质量大小与抗氧化性有明显的相关性[17]。初步确定最佳酶解时间为80 min。

2.2.5 底物质量分数对松仁蛋白粕酶解的影响

分别配制底物质量分数为5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%的松仁粕浆料，调节酶解温度至60℃，pH至9.0，加入碱性蛋白酶8 000 U/g松仁粕，在恒温磁力搅拌器上反应80 min后，终止酶反应，考察底物浓度对水解度和总还原力的影响，结果见图5。

图5 底物质量分数对松仁蛋白粕酶解的影响Fig.5 Effect of substrate mass fraction on hydrolysis of pine nutprotein meal

由图5可知，水解度和总还原力均随底物质量分数增大而升高，当底物质量分数为15%时，水解度和总还原力达到最大值，分别为35.41%、0.672。之后随着底物质量分数继续增加，水解度和总还原力变化不大，趋于平稳。因为当酶添加量一定时增加底物质量分数，但又未能使酶添加量饱和时，则底物质量分数越大，水解度也越高。考虑尽量提高底物浓度且保证生产成本的情况，所以初步确定底物质量分数为15%。

2.3 东北红松松仁粕酶解条件优化响应面试验

松仁粕酶解条件优化响应面试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

表3 松仁蛋白粕酶解条件优化响应面试验结果与分析Table 3 Results and analysis of response surface methodology for pine nut protein meal hydrolysis conditions optimization

表4 响应面试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

由表3、表4可知，以总还原力为响应值的模型中，一次项A、C，二次项A2、B2对总还原力的影响极显著（P＜0.01），交互项AC对总还原力的影响显著（P＜0.05）。本实验所选用的二次多项模型具有极显著性（P＜0.01），失拟项（P=0.400 0＞0.05）不显著，其决定系数R2=0.982 0，表明此模型拟合较好，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

将试验数据利用Design Expert软件进行多元回归拟合，可得到响应值（总还原力）Y和各因子（A、B、C）之间的二次多元方程：Y=-53.70800+1.09483A+4.86750B-0.00019C-0.009 25A2-0.272 5B2-6.843 75E-009C2-0.000 60AB+3.675 00E-006AC+1.15000E-005BC。由方程预测得到最佳酶解条件为酶解pH9.07，酶解温度62.97℃，加入碱性蛋白酶9999.96U/g松仁粕，在此条件下总还原力为0.699 1。为方便实际操作，修改最佳酶解条件为酶解pH 9.0、酶解温度63℃、酶解时间80 min、碱性蛋白酶添加量为10 000 U/g松仁粕底物质量分数15%，经验证得到该条件下，水解物的总还原力为0.69，与预测值接近；此时水解度比优化前提高了2.32%，为36.23%。通过总还原力模型的二次多项回归方程的响应曲面图见图6。

响应曲面坡度相对陡峭，表明响应值对于处理条件的改变非常敏感；若曲面平缓则说明处理条件对响应值影响较小[19]。根据图6可知，酶解温度（A）和酶添加量（C）交互作用对水解物总还原力的影响显著，与表4结果一致。

图6 酶解温度、酶解pH与酶添加量交互作用对松仁蛋白粕酶解总还原力影响的响应曲面与等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interactions between hydrolysis temperature,pH and enzyme addition on total reducing power of pine nut protein meal

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 总还原力的测定

图7 松仁粕抗氧化肽的总还原力Fig.7 Total reducing power of antioxidant peptides of pine nuts

由图7可知，松仁粕抗氧化肽在质量浓度较低时，还原能力与VC相比较差；当质量浓度为14 mg/mL时，松仁粕抗氧化肽的还原能力到达同质量浓度VC的71.16%。

2.4.2 松仁粕抗氧化肽对不同自由基的清除作用

图8 松仁粕抗氧化肽对不同自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of pine nut meal antioxidant peptide on different free radicals

由图8可知，松仁粕抗氧化肽对羟基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基清除均有较强的清除效果，而且随着肽质量浓度的增大，其对不同自由基的清除作用均明显提高。

3 结论

通过试验确定了碱性蛋白酶为酶解松仁粕的最适合酶，在单因素试验的基础上，采用响应面优化得到最佳酶解松仁粕条件为底物质量分数15%、酶解pH 9.0、酶解温度63℃、酶解时间80 min、酶添加量10 000 U/g，该条件下水解物的总还原力为0.69，水解度为36.23%。相比之前的相关报道底物浓度得到了较大的提高。通过优化后的酶解工艺得到的松仁粕抗氧化肽具有较强的总还原能力，其还原能力随浓度升高而增强，存在着明显的剂量依赖关系。当抗氧化肽的质量浓度达到14 mg/mL时，还原能力达到同质量浓度VC的71.16%，而且对羟基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基清除率能力均效果显著。此研究为酶解松仁蛋白粕制抗氧化肽的深入研究提供了理论基础。