卢东升,任雨轩,周 营, 陈 阳
(1. 信阳师范学院 生命科学学院,河南 信阳 464000;2.信阳高级中学,河南 信阳 464000)
空心莲子草[Alternantheraphiloxeroides(Mart.)Griseb.]为苋科(Amaranthaceae)莲子草属(Alternanthera)多年生草本植物[1].其生态适应性强,繁殖迅速,现已成为常见野生杂草,在我国华东、华中、华南及西南等20多个省、市、自治区均有分布.该种植物常形成单一的优势群落,陆生型排挤了本土植物的正常生长,危害当地的生物多样性,在农田与农作物争夺阳光、水分、肥料以及生长空间,造成减产,影响农田作业,同时,其群落内部本土植物的生长空间受到限制.空心莲子草在水生环境中生长迅速,覆盖水域,堵塞水道,影响淡水养殖和农田灌溉,成为世界公认的恶性杂草, 被列入国家环保总局2003年公布的“中国第一批外来入侵生物名单”[2].人们对空心莲子草的适应性、入侵机制、对当地植物群落组成及植物多样性的影响和对其种群扩散的防控等进行了大量研究[3,4].据何丽烂等[5]报道,链格孢菌(Alternariasp.)及尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)为空心莲子草的致病菌.周兵等[6]研究了链格孢菌(Alternariaalternata)不同菌株对空心莲子草的致病性.结果,链格孢菌不同菌株的致病性有明显不同.前人对紫茎泽兰、豚草等入侵植物内生真菌的生态功能进行了研究,研究发现一些内生真菌对宿主植物或入侵地其他植物的种子发芽有显著影响.陈志谊等[7]以紫茎泽兰不同菌属的内生真菌孢子液侵染不同植物的种子,观察内生真菌对植物种子发芽率的影响.实验用炭疽菌(Colletotrichum)、链格孢菌属(Alternaria)、炭角菌属(Xylaria)、拟茎点霉属(Phomopsis)等真菌菌株51个,测试的植物有紫茎泽兰(Ageratinaadenophora)、土牛膝(Achyranthesaspera)、柳叶箬(Isachneglobosa)、凤尾苋(Amaranthuscaudatus)、钮子瓜(Zehneriamaysorensis)、何首乌(Polygonummultiflorum)、地桃花(Urena)、黄花稔(Sidaacuta)、黄葵(Abelmoschusmoschatus)等9种.结果,在所测试的9种植物中,链格孢菌能够对其中的7种植物致病, 炭疽菌能够对8种植物致病,拟茎点霉可以使6种植物致病,炭角菌能够对5种植物致病.这说明,紫茎泽兰内生真菌中含有致病菌,当这些菌释放出来时,能够感染周边部分植物并且降低了这些植物的种子发芽率,从而间接地增强了紫茎泽兰的入侵力.TAN等[8]研究了豚草种子内生真菌发酵液对豚草种子发芽的影响.结果显示,供试的内生真菌菌株的发酵液均不同程度地抑制豚草种子发芽.但内生真菌发酵液处理后的种子仍然保持较高程度的活力,不同内生真菌发酵液处理后,有活力的种子维持在50%~87.5%之间,均高于(或等于)清水处理的种子,说明内生真菌代谢产物只是抑制种子的发芽,但并不导致种子的腐烂和死亡.这些研究结果初步显示种子携带的内生真菌可能在豚草入侵生物学中发挥重要的作用.但未见有关空心莲子草内生真菌的报道.内生真菌是存在于健康植物体内的真菌种类,其对宿主植物的生长、发育、生理、生态以及对不良环境的抗性均有重要影响.因此,开展空心莲子草内生真菌的研究,有助于了解其入侵机制,对该草的防控及内生真菌资源的利用具有重要意义.为此,于2017年7月至9月,对河南省信阳地区分布的空心莲子草内生真菌种类、分布及多样性进行了研究.
在河南省信阳市选取5 个不同生境条件下的空心莲子草样地 (编号为 SY1、SY2、SY3、XYH、ZHL),样地情况见表1.选健康空心莲子草植株,采集新鲜枝叶,装入无菌纸塑料袋中,带回实验室备用,当天采集的材料当天完成植物组织的消毒及接种培养.
表1 空心莲子草5个样地生境Tab. 1 The five sample plot habitats of Alternanthera philoxeroides
参照文献[9]对叶栖内生真菌进行分离.
茎内生真菌分离前,用自来水反复冲洗去除表面杂物,晾干表面水后将茎切成3 cm长的茎段,分别用75%乙醇、2%次氯酸钠、75%乙醇消毒2、10、1 min,不同消毒剂消毒后均用无菌水冲洗3次,最后用无菌纸吸去表面水后将茎段切成 0.5 cm 短段.将茎段接入PSA平板培养基,放入28 ℃恒温箱内培养3~4 d,当组织块出现明显菌落时,依据菌落形态特征挑取不同真菌顶端菌丝转接至PSA 斜面培养基进行纯化,25 ℃恒温培养.将纯化后的真菌再次接入PSA平板培养基进行培养,菌落满皿后,诱导产孢.观察记录菌落、菌丝、产孢结构及孢子形态结构特征,参照文献[10-12] 进行鉴定.
统计内生真菌在空心莲子草组织内的种数、不同组织中的定殖率、分离率,参照文献[13]计算其多样性指数、相似性系数.聚类分析用SPSS19统计软件,以不同组织及不同样地内生真菌种类组成、分离率、丰度、定殖率建立数据库,经系统聚类,按组间连接方法计算区间平方欧氏距离,构建聚类树形图.
本研究供试空心莲子草健康组织774块,经培养,有632块得到了内生真菌,内生真菌的得菌率为81.7%.对内生真菌进行分离纯化,共得到真菌菌株360个,经鉴定有真菌16种.15种为半知菌.经统计,不同真菌种类以及同种真菌在不同组织内的分离率存在较大差异.其中,曲霉1(Aspergillussp. 1)、曲霉2(Aspergillussp. 2)、刺盘孢菌(Colletotrichumsp.)、大茎点霉(Macrophomasp.)、弯孢霉菌(Curvulariasp.)在供试的各种组织均有分布,且分离率较高,是空心莲子草的优势内生真菌,见表2.样地不同,组织不同,其内生真菌的定殖率不同.供试的5个样地中,以样地XYH内生真菌的定殖率最高,达89.7%,样地SY1内生真菌的定殖率最低,为76.8%.供试的5种组织中,以老茎定殖率最高,达90.9%,嫩茎的定殖率最低,为70.2%,见表3.另外,各样地间,空心莲子草内生真菌种群结构也存在明显差异.单端孢菌、镰刀菌和小穴壳菌等3种菌仅分布于样地SY2,壳梭孢菌仅分布于样地ZHL,青霉2仅分布于样地XYH.这说明,空心莲子草体外环境与体内环境对其内生真菌的群落结构有重要影响.
表2 空心莲子草不同部位内生真菌种类及分离率Tab. 2 The endophytic fungal species and the separation rate of different parts of Alternanthera philoxeroides
续表2
表3 空心莲子草不同部位内生真菌的定殖率Tab. 3 The endophytic fungi colonization rate in the different parts of Alternanthera philoxeroides
空心莲子草内生真菌有16种,种类较丰富.但样地不同、组织不同,其内生真菌的丰度有明显不同.样地SY1、SY2、SY3、XYH、ZHL的真菌种数依次为10种、10种、6种、9种和10种.其中,样地SY1、SY2、ZHL真菌种数较多,样地SY3真菌种数较少.嫩茎、老茎、叶尖、叶中、叶基组织内的真菌种数依次为9种、10种、12种、9种、10种.以叶尖分离得到的真菌种类最多,老茎、叶基次之,嫩茎得到的真菌种类最少.对空心莲子草不同样地不同组织内生真菌多样性指数进行统计,结果,样地不同、组织不同,其真菌多样性指数也不同.其中,样地ZHL最高,为2.13,样地SY1最小,为1.87(表4).对不同样地的空心莲子草内生真菌群落进行比较,样地之间的相似系数区别明显.其中,样地SY1与样地SY3之间相似系数最大,为0.900,样地SY2与样地XYH之间相似系最小,为0.667(表5).上述结果说明,空心莲子草的生境及组织类型对空心莲子草的真菌丰度、多样性及相似性都有影响.
表4 空心莲子草不同部位内生真菌的多样性指数Tab. 4 The endophytic fungi diversity index in the different parts of Alternanthera philoxeroides
表5 空心莲子草不同样地间内生真菌的相似系数Tab. 5 The endophytic fungi similarity coefficient between sample plot habitats of Alternanthera philoxeroides
以空心莲子草5种组织内生真菌的群落结构、真菌种类及分离率为参数进行聚类分析,组织类型聚为2大类,老枝与嫩枝组织聚为一类,叶尖组织、叶中组织与叶基组织聚为一大类.叶器官3种组织中,叶尖与叶中聚为一小类,叶基为一小类(图1).此结果说明,空心莲子草组织类型越相似,其内生真菌群落结构及真菌种类也越接近.以空心莲子草5个样地内生真菌的定殖率及真菌丰度为参数进行聚类分析,样地类型聚为3类,SY1、ZHL和SY2聚为一类,SY3和XYH各为一类(图2).这说明,空心莲子草生境对其内生真菌的定殖率及丰度有重要影响.SY1、ZHL和SY2三个样地环境相似,均为光照充足的空旷之地.样地SY3与XYH均为树荫下,与上述三个样地差异较大,但样地XYH为湿地,样地SY3为旱地,二者湿度有较大差异,这与聚类分析结果较相似.
图2 空心莲子草内生真菌不同样地聚类分析Fig. 2 The endophytic fungi cluster analysis of differentsample plots of Alternanthera philoxeroides
空心莲子草茎和叶栖居有内生真菌,但器官、组织不同,内生真菌种类不同,叶尖组织内生真菌种类最多.空心莲子草内生真菌种类丰富,主要为半知菌.其中,曲霉1(Aspergillussp. 1)、曲霉2(Aspergillussp. 2)、刺盘孢菌(Colletotrichumsp.)、大茎点霉(Macrophomasp.)、弯孢霉菌(Curvulariasp.)是优势内生真菌.生境及组织类型对空心莲子草内生真菌的群落结构及定殖率有重要影响.
本研究仅对空心莲子草内生真菌多样性进行了初步观测,有关这些内生真菌生态功能以及他们在宿主植物入侵生物学中所具有的作用,均需要深入研究.