犬源粪肠球菌的分离与鉴定

陆璐，张希墨，刘燕霏，杨建德



犬源粪肠球菌的分离与鉴定

陆璐，张希墨，刘燕霏，杨建德通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300380）

随着都市宠物业的发展，伴侣动物的化脓性疾病日趋增多。为探究其影响病原，本研究对一例犬子宫蓄脓的浓汁进行了病原学鉴定。利用细菌学检测方法对采集到的病料进行分离纯化、涂片染色、镜检和生化鉴定，然后采用16S rRNA基因序列分析鉴定，发现该分离株的形态特征、生化结果与粪肠球菌一致，分离菌株的16S rRNA也与参考的粪肠球菌菌株同源性高达99%。药敏试验检测发现，该菌株对四环素、青霉素G、米诺环素、红霉素、诺氟沙星、环丙沙星、万古霉素、左氟沙星、克林霉素、多粘菌素B、氯霉素、复方新诺明和克拉霉素表现为耐药，对苯唑西林和呋喃妥因敏感。这些研究结果可为治疗此类多重耐药性肠球菌感染提供参考。

粪肠球菌；生化鉴定；进化树分析；药敏试验

粪肠球菌又称粪链球菌，革兰氏染色为阳性，是人和动物肠道内主要菌群之一[1]。粪肠球菌能在不同环境中生长存活，常定居于动物肠道、口腔、生殖道，其能产生天然抗生素，有利于机体健康[2]。以往认为粪肠球菌是人类及动物的共生菌，但在近十几年来粪肠球菌已逐渐成为人体内革兰氏阳性菌感染仅次于葡萄球菌的第二大病原菌[3]。粪肠球菌能够频繁地引起人类的广泛感染，医院内病人感染和死亡的病例数逐渐增加，尤其见于免疫力低下或患有危重基础疾病患者[4]。这些机体感染大多数发生在泌尿道、血液循环、心内膜腹腔、胆管、烧伤处及类似组织等。肠球菌还能感染中枢神经系统、肺、软组织、鼻旁窦、眼和牙周组织，但这些组织感染频率较低[5]。在许多欧美国家，粪肠球菌感染严重威胁着人类公共健康，在中国也已从猪、羊等动物体内分离到致病性粪肠球菌[6]。近年来，动物感染粪肠球菌发病和死亡的报道也日益增多，常引起公猪睾丸炎、鸡败血症、牛乳腺炎、犊牛或羔羊心内膜炎及犬尿道感染等疾病[7]。抗菌药物的大量使用，使粪肠球菌进化出许多针对抗生素的机制，并产生了对应的耐药机制[8]。

本试验采集患病犬的子宫蓄脓脓汁，经分离培养获得一株细菌，命名为E f-lu，对其进行了形态学观察、生化试验、药敏试验、菌株16S rRNA的扩增与测序分析。

1 材料与方法

1.1 病料

患病犬为送往天津农学院附属动物医院的10岁雌性德国牧羊犬，症状表现为阴道分泌物呈黄色，气味难闻，腹围略增大。手术切除其蓄脓子宫，无菌采集脓汁用于病原分离。

1.2 主要试剂

1.2.1 培养基和生化鉴定管

制备普通肉汤培养基、营养琼脂培养基、哥伦比亚琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，以上培养基均按常规方法[9]制备。链球菌鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2.2 药敏纸片

药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离培养

将脓汁无菌接种于培养基上，然后挑选出优势菌落进行纯培养，分别在普通营养琼脂平板和哥伦比亚琼脂平板划线，于37 ℃温箱中培养24 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 涂片染色镜检

挑取分离的单个菌落进行涂片、革兰氏染色，置于油镜下观察细菌形态排列及染色特性，染色方法按照文献[10]要求进行。

1.3.3 生化特性鉴定

生化试验参考《常见细菌系统鉴定手册》，用分离菌的纯培养物分别接种于精氨酸、蔗糖、七叶苷、VP试验等生化鉴定管中，37 ℃培养24 h，观察并记录生化反应结果。

1.3.4 分离菌株16S rRNA同源性分析与进化树构建

将获得菌株送往上海生工公司测16S rRNA基因序列，将获得的基因序列在NCBI数据库中进行Blast相似性搜索，获取与分离株16S rRNA序列最为相近的序列。采用DNAstar软件进行多序列同源性比对，分析，并构建系统发育树。

1.3.5 药敏试验

采用平板表面散布法。将分离菌株的肉汤纯培养物100 μL（109CFU）均匀地涂抹于事先准备好的营养琼脂平板上，再将药敏片贴于营养琼脂培养基上，贴好纸片的平板于37 ℃ 温箱中倒置培养24 h，观察和测量药敏试验的抑菌圈直径，记录结果，分析其药物敏感情况。

2 结果

2.1 分离培养特性、细菌形态及染色特性

经过分离培养所得细菌在营养琼脂中，形成乳白色、不透明、表面光滑、边缘整齐的圆形小菌落，见图1，哥伦比亚琼脂菌落稍大，在麦康凯培养基上不生长。涂片染色，镜检为革兰氏阳性球菌，多呈双球状排列，亦有少数为单个存在，见图2。

图1 分离培养结果

图2 革兰氏染色镜检结果

2.2 生化试验结果

髓鞘关联糖蛋白、精氨酸、蔗糖、曲美他嗪、蕈糖、七叶苷、VP试验为阳性；DP试验、草甘膦、山梨醇为阴性。参考标准菌株的生理生化特性，该分离菌株与肠球菌一致，故初步判定为肠球菌。详情见表1。

表1 分离菌生化特性试验结果

注：“＋”为产酸；“－”为不分解

2.3 16S rRNA同源性结果分析

将此序列在NCBI网站上进行Blast对比，与粪肠球菌属的相似性高达100%。将分离菌株16S rRNA的基因序列经DNAstar软件分别与数据库中16S rRNA进行同源性分析，结果表明，分离菌株的16S rRNA序列与粪肠球菌具有高度的同源性，同源性均为99%以上。见图3。

注：左下角数据为遗传距离，右上角数据为同源性

2.4 16S rRNA基因进化树分析结果

将分离菌株的16S rRNA序列经DNAstar软件中的MegAlign分别与10株数据库中的序列进行进化树构建，结果见图4。分离菌株E f-lu与数据库中的EU794735.1和MF369842.1亲缘性最近，而与MG543833.1和KP090135.1亲缘性相对较远,与EU708623.1，KM497509.1，KP090135.1和MG543833.1同源性最高，均为99.5%。

2.5 药敏试验结果

测定了该菌对万古霉素、米诺环素、氯霉素、苯唑西林、克林霉素等抗生素的耐药性，显示该菌株对于所有本试验测定的药物基本上全耐药，只对苯唑西林和呋喃妥因敏感。详见表2。

表2 分离菌株药敏试验结果

续表2

药品名称药物含量判断标准/mm抑菌圈直径结果耐药中介敏感μgmm 克拉霉素15≤1314～17≥180R 四环素30≤1415～18≥190R 米诺环素30≤1213～15≥167R 诺氟沙星30≤1213～16≥170R 环丙沙星5≤1415～21≥220R 左氟沙星5≤1314～16≥170R 多粘菌素B100≤89～11≥120R 复方新诺明30≤1011～15≥160R 呋喃妥因100≤1415～16≥1717S

注：“R”表示耐药，“S”表示敏感

3 讨论

粪肠球菌可引起泌尿生殖道感染、菌血症、败血症、创伤感染、心内膜炎和皮肤软组织感染等疾病[5]，在2010—2014年，江丹英等[11]从其所在医院临床标本中分离出1 220株肠球菌，其中粪肠球菌675株（55.3%），屎肠球菌445株（36.5%）。虽然粪肠球菌在临床感染中占优势地位，但在犬临床子宫蓄脓疾病中却很少出现。2013年，石翠云对43例犬子宫蓄脓进行了病原学鉴定，发现分离到的主要是革兰氏阴性杆菌，其中绝大部分是肠杆菌科成员，少部分是假单细胞菌属的铜绿假单胞菌；也有革兰式阳性球菌，包括粪肠球菌和葡萄球菌，但其比例仅占子宫蓄脓总数的15%[12]。

本次试验从犬子宫蓄脓脓汁分离出的粪肠球菌，通过药敏试验测定，对万古霉素、米诺环素、克拉霉素、氯霉素等耐药，只对苯唑西林和呋喃妥因敏感，为多重耐药菌株。连顽固性耐药的万古霉素也被粪肠球菌攻破，这引起了中国CHINET细菌耐药性监测网对其高度重视[13]。

由于粪肠球菌普遍存在于猪群、羊群、牛群、禽饲养场、医院及动物诊所中，长期的抗菌素使用不当，导致粪肠球菌的耐药性不断增强，使治疗粪肠球菌感染越来越困难。目前，用于预防粪肠球菌病的疫苗还未普及，还处于实验室研究阶段[14]。多重耐药菌可在人类、动物和环境之间传播，使细菌耐药问题日益严重，可对人类公众健康造成严重威胁[15]。因此，治疗粪肠球菌感染不仅要阐明其主要的致病机理，还需加强人和动物抗菌素的合理、规范使用。

[1] 王亚宾，陈丽颖，胡慧，等. 猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立[J]. 中国兽医学报，2011，31（8）：1123-1127.

[2] Malik R K，Montecalvo M A，Reale M R，et al. Epidemiology and control of vancomycin-resistant enterococci in a regional neonatal intensive care unit[J]. Pediatr Infect Dis J，1999，18（4）：352.

[3] Toledo-Arana A，Valle J，Solano C，et al. The enterococcal surface protein，Esp，is involved inbiofilm formation[J]. Appl Environ Microbiol，2001，67（10）：4538-4545.

[4] Creti R，Imperi M，Bertuccini L，et al. Surver for virulence determinants amongisolated from different sources[J]. J Med Microbiol，2004，53：13-20.

[5] 刘燕霏，杨建德，赵瑞利. 粪肠球菌动物致病的研究进展[J]. 家畜生态学报，2013，34（11）：75-77.

[6] 王亚宾，陈丽颖，张红英，等. 感染仔猪粪肠球菌不同分离株的鉴定及毒力基因的检测[J]. 中国兽医学报， 2010，30（5）：615-619.

[7] Ana R F，Ana P T，Carla N，et al. Global spread of the hylemf colonization virulence gene plasmids of theCC17 polyclonal sub cluster[J]. Chemother，2010，54（6）：2660-2665.

[8] 王送林，李芸芳，刘秋菊，等. 湖南省猪源粪肠球菌耐药性分析[J]. 中国动物传染病学报，2015，23（2）：41-46.

[9] 胡桂学，廖明，彭远义，等. 兽医微生物学实验教程[M].北京：中国农业出版社，2006.

[10] 崔保安，牛钟相，任家，等. 动物微生物学[M]. 3版.北京：中国农业出版社，2005.

[11] 江丹英，林雪峰，王兵勇，等. 医院感染肠球菌的临床分布及耐药性分析[J]. 中国现代医生，2015，53（35）：99-102.

[12] 石翠云. 43例犬子宫蓄脓细菌的分离及子宫壁病理组织学与免疫组化变化的研究[D]. 扬州：扬州大学，2016.

[13] 胡付品，朱德妹，汪复. 2011年中国CHINET细菌耐药性监测[J]. 中国感染与化疗杂志，2014，14（5）：365-374.

[14] 吕娜，高原. 粪肠球菌致病因子的研究进展[J]. 内蒙古民族大学学报，2015，30（4）：323-326.

[15] 王娟，王新华，徐海. 多重耐药菌在人类、动物和环境的耐药和传播机制[J]. 微生物学报，2016，56（11）：1671-1679.

责任编辑：张爱婷

Isolation and identification of canine

LU Lu，ZHANG Xi-mo，LIU Yan-fei，YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

With the development of the urban pet industry, suppurative diseases of companion animals are increasing day by day.To explore its associated pathogens, this study was performed on etilolgical identification from a case of a canine uterus with pus. Bacteriological detection method was used to isolate and purify the collected disease materials, such as smear staining, microscopic examination and biochemical identification. Then, 16S rRNA molecular sequence analysis was used to identify the the isolated strain. It was found that the morphological features of the isolated strain and the biochemical results were consistent with the. The 16S rRNA of the isolated strain was also as high as 99% homologous with the reference stains. Drug susceptibility test showed that the isolate was resistant to tetracycline, penicillin G, minocycline, erythromycin, ciprofloxacin, norfloxacin, vancomycin, levofloxacin, clindamycin, polymyxin B, chloramphenicol, compound sulfamethoxazole, and clarithromycin, and only sensitive to oxacillin and nitrofurantoin. These results provided a reference for the treatment of this type of multidrug-resistant enterococcal infection.

; biochemical identification; evolutionary tree analysis; drug sensitive test

S852.611

A

2018-01-30

天津农学院大学生创新创业项目（201710061193）；天津自然科学基金项目（07JCYBJC16000）；天津农学院附属动物医院项目（ZH004903）

陆璐（1997-），女，本科在读，主要从事预防兽医学方面研究。E-mail：1043146254@qq.com。

杨建德（1969-），男，教授，博士，主要从事预防兽医学方面的教学与研究。E-mail：jiandeyang@126.com。

1008-5394（2018）02-0047-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.012