应用PCR技术检测低氧小鼠BDNF基因效果探析

吴晓东，杨 锦，郝云兰，高晓宇，谢 伟，侯 林，崔海红，张芳芳

（1.包头医学 院基础学院；2.包头医学院 麻醉学院；3.包头医学院 公共卫生学院，内蒙古 包头 014040；4.内蒙古民族大学 动物科学技术学院，内蒙古 通辽 028000；5.泰山医学院药理学研究所，山东 泰安 271016）

1 引言

多聚酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一种体外扩增合成特异性DNA片段的方法[1]，扩增过程包括变性、退火以及延伸等反应，在经多次循环反应后，使得目的基因片段得以快速扩增,其具有灵敏度好、特异性强、操作简便、迅速等特点.PCR技术不但用于基因序列分析、鉴定、扩增等基础研究,而且还可用于多种疾病的基因诊断.

低氧是目前临床医疗中常见的病症，也是各类致死疾病的主要原因[2].研究表明低氧作用具有双重性，即急性严重的缺氧导致机体损伤，而适度低氧或低氧预适应对机体有益的保护作用.这主要取决于低氧的程度和持续的时间.因此，这种双重作用和其调节机制也越来越受到关注.而低氧预适应作为机体抵抗缺氧损伤的一种内源性保护机制[3]，当机体经过多次短暂、非致死性的低氧刺激后，神经系统在内的多个组织对低氧损伤的耐受性均有增加，这种机制更倾向于对机体的保护，所以目前该机制还尚未明确.

BDNF是在脑内合成的一种蛋白质[4]，广泛分布于中枢神经系统内，具有减少神经元损伤和死亡、监视神经元病理状态以及调控受损神经元分化和再生等生物学功能.研究发现[5]，急性低氧损伤可造成BDNF其信号通路的改变.而低氧预适应的神经保护机制是否涉及BDNF仍未有定论.因此，本文通过PCR技术扩增低氧小鼠的BDNF基因，来研究总结了不同类型低氧即急性低氧和低氧预适应对BDNF的影响以及对BDNF信号通路途径中发挥的作用，为后续低氧研究特别是为低氧机制研究提供一些要参考.

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 材料及试剂

18g～22g雄性小鼠20只；细胞裂解液，Thermo公司产品；DNA合成引物，生物工程（上海）有限公司；PCR Mixture，北京康为生物技术有限公司；DEPC水；琼脂糖购自美国；TBE液（MCE公司产品）；苦味酸；其他试剂及器材均由包头医学院中心试验室提供.

2.1.2 仪器设备

超声波细胞粉碎机（JY98-16）；微量分光光度计（Nondrop2000）； 低 速 离 心 机 （H1208）； 移 液 枪（Thermo，YM16AA0067439）；冷冻离心机 （Thermo701）；混匀仪（MX-H/RL-O）；振荡器（8HZ-81）；微波炉（HAIER）；PCR 仪（ARKTIK）；电泳仪（BIO RAD，Wide Mini-Sub Cell GT）；全自动凝胶成像系统（Tocan240）等.

2.2 方法

2.2.1 小鼠低氧模型的建立

将实验雄性小鼠放入250 mL的瓶中，塞紧盖子，迅速记下起始时间，观察小鼠的呼吸状态.当实验小鼠到达低氧非致死状态时，即小鼠出现仰呼吸急促，急躁，最后出现痉挛.快速拔下盖子，快速取出实验小鼠，记录缺氧时间，该小鼠为低氧1次，则低氧1次小鼠模型构建成功，实验结束.继续重复上述步骤4次，取出小鼠后，记录4次时间，该小鼠为低氧4次小鼠，则低氧4次小鼠模型构建成功，实验结束.未低氧直接处死的小鼠记为对照组.小鼠低氧结束后，处死并立即剥离小鼠海马，放入1.5 mL的EP管中，在-80℃的冰箱中冻存.

2.2.2 PCR反应

2.2.2.1 引物的合成与设计 引物由Invitrogen公司合成，引物基因序列见表1.引物稀释，5μL上引物加5μL下引物再加90μL dd H2O.

表1 基因引物序列

2.2.2.3 扩增及电泳 扩增，放入ARKTIK PCR仪中，反应条件为预变性温度 95℃5min；95℃30s，退火温度 59℃30s，72℃30s共 40 个循环，72℃2min 延伸. 配胶，0.2g～0.4g琼脂糖凝胶；20ml～40ml TBE液；微波炉加热至清澈透明；不烫手时加入一点EB液；倒入电泳槽中；插入木梳；凝胶冷却30min.电泳，拔出木梳并每空加样4μL，电泳结果见图3.

3 结果

3.1 基因组DNA的纯度与浓度的检测结果

用微量分光光度计（Nondrop2000）检测序列基因DNA的纯度和浓度结果如图1和表2所示.显示所检测样品的序列基因DNA紫外吸光值（OD260/280）均在1.80～2.00之间，说明DNA的纯度和浓度较好，可用于本试验操作.

图1 核酸浓度曲线

表2 DNA的浓度和纯度

3.2 重复低氧后可以提高小鼠低氧耐受时间

小鼠缺氧耐受时间随着低氧次数的增加而双倍增加，即后4次低氧耐受时间比前1次耐受时间更明显（*P＜0.05），可见当低氧预适应后小鼠的耐受时间增加了.

图2 小鼠不同低氧次数的耐受时间记录

3.3 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果

应用PCR扩增BDNF基因电泳检测结果见图 3结果所示：：①低氧一次小鼠组泳道 2，3，4，5，6，7 并且与对照组相比条带亮度增加了，说明小鼠急性低氧时BDNF基因表达增加了②低氧四次小鼠组泳道 8，9，10，11，12 扩增出BDNF基因并且与对照组相比条带亮度减少了，说明小鼠低氧预适后BDNF基因表达降低了③急性低氧时小鼠可能通过表达BDNF基因，对其神经损伤起到了修复作用，而随着小鼠对低氧环境的适应这种保护机制出现了降低趋势，这有待于我们继续去研究.

图3 PCR扩增BDNF基因电泳检测结果

3 讨论

PCR技术具有快速简便检测目的基因的效果[6]，本实验通过PCR扩增结果可知低氧预适应小鼠可能是过表达了BDNF基因，从而对其神经损伤起到了修复作用，而急性低氧小鼠对低氧环境的适应这种修复作用出现了降低趋势.近期研究也发现[7]，急性低氧与低氧预适应都可能通过调控BDNF的表达，从而影响脑的结构和功能，但是激活下游途径的机制不同，产生的结果也不相同.当机体缺氧时，BDNF在调节中枢神经系统生存和死亡的过程中发挥着至关重要的作用[8].通过检测缺氧对BDNF表达的影响时发现，当急性缺氧处理后，其能够调控BDNF在神经细胞中的表达，进而神经细胞的损伤.Tian的小鼠低氧实验通过低氧刺激诱导BDNF和TrkB受体的表达也证实了二者在神经系统中发挥着重要作用[9].另外，将神经细胞置于24小时常氧和急性低氧情况下同时培养，BDNF与在急性低氧条件下的结合明显减少[10].研究还表明，BDNF诱导启动子的活性增加，可能是启动了相关缺氧反应元件的突变[11].Scott等研究发现[12]，当BDNF作用于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞TrkB受体（AMC）时，低氧预适应组、暴露在急性缺氧组和正常对照组三者相比，其AMC的TrkB受体兴奋性升高，细胞内BDNF和儿茶酚胺的分泌也明显增加.TrkB通过与配体BDNF结合，在后期低氧损伤的神经元中发挥着重要调节作用[13].小鼠低氧预适应时可以刺激神经细胞中的BDNF表达上调，这为我们后期的相关机制的研究具有重要的参考价值.

5 结语

近年来，随着低氧神经保护作用研究的不断深入，已经逐渐发现了低氧具有双重作用，既可能产生损伤，又可产生对机体有益的保护作用，这主要取决于低氧的程度和持续的时间，以及激活反应体系不同而论.随着低氧对BDNF作用机制中的一些新的信号蛋白和信号通路的发现，其机制也越来越受到关注.本文应用PCR技术扩增了低氧小鼠BDNF基因，归纳了脑源性神经营养因子在神经研究方面的最新进展，低氧后对小鼠低氧耐受时间进行了分析.除此之外，还分别对急性低氧和低氧预适应对BDNF的影响和表达进行了更新.然而，到目前为止，低氧损伤与低氧预适应对BDNF及其信号通路的具体影响机制还有待我们进一步探究.