保健食品中合成色素的反相高效液相色谱检测法

◎ 班素侠

（沛县检验检测中心，江苏 徐州 221600）

保健食品亦称功能性食品，以补充人体营养素为目的。保健食品是一个特定的食品种类，可调节人体功能，适于特定人群食用，剂型有胶囊壳、胶囊、片剂，它的食用色素着色好且价格实惠，为了使保健食品呈现更为舒服的视觉效果以及更具吸引力，保健食品经常会采用着色剂。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：检测仪、漏斗、天平和色谱柱。检测仪使用LC-20，AD配备有二极管的高分离度液相色谱仪，G3垂融漏斗规格为XS 205，G3砂芯滤板漏斗LC-20AD，C18色谱柱规格为4.6 mm×250 mm，5 μm以及电子天平和0.45 μm水相过滤膜。

试剂：UP水（Ultrapure water），源美制造；磷酸二氢铵、甲酸、氨水，均为分析纯；甲醇、乙醇，均为色谱纯[1]。

1.2 标准品

亮蓝纯度大于99.7%，柠檬黄纯度大于91.0%，日落黄纯度规格GBW(E)10003 a，0.5 mg/mL；赤藓红纯度大于91.7%，诱惑红纯度大于80.0%。

1.2.1 标准液的制备

按照标准规格制备标准液，浓度为1.0 mg/mL，首先取适量需要配制的标准品加入25 mL容量瓶中，并使用水定容，逐渐将溶液调制为标准浓度。另外需要注意的是，日落黄其标准的储备溶液与正常溶液浓度不同，浓度为0.5 mg/mL[2]。

1.2.2 混合液的制作配备

混合液需要多种标准液混合在一起，可将既定需要混合的标准液进行混合，混合时首先需要用水将其稀释，进而制备成不同含量的混合液，分别为2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL，配好后保存待用。

1.3 色谱条件

色素条件主要观察色谱柱，其规格4.6 mm×250 mm，5 μm，检测波长254 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。流速l mL/min。具体梯度条件见表1。

表1 流动相梯度条件表

1.4 样品处理

称取一定量的片剂研磨，直到研钵中的片剂磨成均匀细碎的粉状后称样。除片剂外还有胶囊和胶囊壳，胶囊壳的制作是将胶囊内的粉粒状物全部取出，用棉签擦拭胶囊壳直至其完全干净无粉粒残留进行称样[3]。将这些试样取出一定量倒进100 mL小烧杯中，然后注入30 mL的水并将水温加至温热至样品溶解，以60 ℃为准，取1 g聚酰胺粉与水慢慢调制成粥状，进而倒入方才溶解试样的溶液中进行搅拌。进一步将其洗涤，首先用G3垂熔漏斗过滤过的60 ℃水洗涤3次，进而将甲醇60%与甲酸40%混合好的溶液再洗涤3次，将其洗涤成中性溶液，接着用混合乙醇70%以及氨水20%以及水10%的混合液对溶液进行解吸，一共分4次进行，每次需要5 mL，在解吸后用乙酸进行溶液中和，进而蒸发定容，最后将溶液处理为5 mL，最后用0.45 μm滤膜对溶液进行过滤，做液相色谱检测。

1.5 稳定性试验

每间隔2 h对标准混合液以液相色谱检测法的色谱条件进行取样分析，及时记录这6种着色剂组分的标准工作曲线的线性关系及相关系数，实验结果表明，各种分浓度与峰面积呈良好线性关系，以3倍噪声比确定最低检出限。线性范围、回归方程、相关系数及检出限见表2。

表2 标准曲线的回归方程、线性范围及相关系数表

2 结果与讨论

2.1 流动相种类与梯度洗脱程序的选用

着色剂中为水溶性则容易在水中溶解，这些溶液其中的理化性质都存在一定程度的相似性，尤其水溶性着色剂中的乙酸铵，其水溶性相比其他溶液更为优质，经常会被当作缓冲溶液来用，但其本身也带有腐蚀性，且腐蚀对仪器，有清洗难度。因此为得到更好的分离比，需要根据GB/T 5009.35-2003，对流动相以及梯度洗脱程序进行选用，本次选择的流动相为0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液与甲醇，对其进行洗脱，这6种合成色素在分离程度上都呈现较好分离结果，如图1、2、3，并且基线平稳，灵敏度上也有较高的效果。

图1 混合标准溶液色谱图（50μg/mL）

图2 某胶囊壳样品色谱图

图3 某片剂样品色谱图

2.2 稳定性试验

每间隔2 h对标准混合液以液相色谱检测法的色谱条件进行取样分析，及时记录这6种着色剂的峰面积并计算RSD，见表3。

表3 稳定性实验表（峰面积）

2.3 样品试验结果及重复性试验

按照第一部分的样品处理相关程序对片剂以及胶囊壳、胶囊进行处理后进行色谱分析，结果见表4。依照GB 2760-2014所规定的着色剂标准，可得出测试的样品中也就是这6种合成着色剂都符合规定的标准，无一超出，见表5。

表4 部分实际样品检测结果表（单位：g/kg）

表5 片剂样品重复性实验表（单位：g/kg）

3 结论

本文按照RP-HPLC的方法探讨反相高效液相色谱检测法，测试时采用合成着色剂为样例，并根据保健食品本身的特点以及样剂的剂型的不同进行针对性地检测。本次研究所采取的方法易操作且实验速度上把握良好，混合色素的分离较为顺利且结果上分离度也呈现较好状态，样品稳定性上也呈现良好结果，在回收率上也呈现较为理想的状态。因此本次方法适合保健食品不同着色剂各种剂型的分离检测。