重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗免疫效果评估

陈裕华，朱建翠，沈 丹，杨建宇，于 飞，何日文

（广州市动物卫生监督所，广东广州 510440）

禽流感病毒是正粘病毒科流感病毒属单链负股RNA病毒[1]。禽流感病毒亚型众多，病毒表面糖蛋白血凝素（HA）有16种（H1－H16），神经氨酸酶（NA）有9种（N1－N9）。HA和NA的抗原变异是相互独立的，各亚型之间缺乏交叉保护，同一亚型病毒有不同的变异株[2]。高致病性禽流感是A型流感病毒引起的以感染禽类为主的烈性传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。

目前，各国采取的禽流感预防和控制措施各不相同。我国采用免疫和扑杀相结合的防控策略。疫苗免疫仍是我国当前预防高致病性禽流感的重要手段。2005年我国开始实施H5N1亚型高致病性禽流感全面免疫政策。此后至今，疫苗毒株从Re-1株、Re-4株、Re-5株、Re-6株、Re-8株，更替到现在的Re-10株[3]。2017年1月，对鸡具有高致病性的H7N9变异株被证实，3月24日农业部公布了我国第一起蛋鸡H7N9高致病性流感疫情。2017年7月7日，农业部办公厅下发《农业部关于切实做好全国高致病性禽流感秋季免疫工作的通知》（农办医〔2017〕24号），要求各地在2017年秋季统一用重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）（以下简称“H5+H7”二价灭活疫苗）替代重组禽流感病毒H5二价或三价灭活疫苗，对家禽实施免疫[4]。为更好地了解家禽H7N9流感的免疫效果，广州市动物卫生监督所开展了田间 “H5+H7”二价灭活疫苗免疫效果评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 肉鸡（江村黄鸡）、樱桃谷白鸭、黑棕鹅（以下分别简称鸡、鸭、鹅）各120只。在选定的养殖场按常规方法饲养至出栏。

1.1.2 试验疫苗 “H5+H7”二价灭活疫苗（批号2017014）：哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.3 检测试剂 禽流感H5N1亚型HI试验抗原和阳性血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产；H7亚型HI试验抗原和阳性血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序 鸡9日龄首免，剂量0.3 mL，30日龄二免，剂量0.5 mL；鸭15日龄首免，剂量1.0 mL；鹅15日龄首免，剂量1.0 mL，50日龄二免，剂量1.5 mL（表1）。

表1 家禽重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗免疫程序

1.2.2 母源抗体测定 对鸡、鸭、鹅，分别于9日龄、15日龄和15日龄，各采集血清10份测定母源抗体。

1.2.3 采集活禽咽肛拭子及血清 随机选取一定数量的活禽，采集每只家禽咽喉、泄殖腔棉拭子各1个，放入事先加入1 mL PBS液的离心管中，咽肛棉拭子与血清一一对应。采集鸡、鸭、鹅咽肛拭子及血清的时间点和样品量详情见表2。咽肛拭子−70 ℃保存待检，血清−20 ℃保存待检。

1.2.4 HI抗体效价测定 按照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2003）中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术进行。用H5N1亚型HI试验抗原和阳性血清检测H5抗体，用H7亚型HI试验抗原和阳性血清检测H7抗体。HI效价≥4 log2判定为合格。

表2 活禽咽/肛拭子及血清采集情况 单位：份

1.2.5 填写“免疫后临床观察表” 免疫后需每日填写禽群的采食量、精神状况、发病与死亡情况、注射部位有无异常等信息。

1.2.6 数据整理和分析 对检测结果用Excel、

SPSS 20.0等软件，进行数据整理、统计分析。

2 结果

2.1 母源抗体测定情况

9日龄鸡的H5和H7母源HI抗体效价几何平均值（GMT）分别为7.3 log2和1.0 log2，15日龄鸭的H5和H7母源HI抗体效价GMT分别为3.3 log2和0，15日龄鹅的H5和H7母源HI抗体效价GMT分别为2.3 log2和0.3 log2（表3）。

表3 实验动物母源抗体测定情况

2.2 免疫效果监测情况

2.2.1 免疫鸡群的HI抗体水平 试验结果显示：首免后21 d，免疫鸡群H5亚型HI抗体效价均值为4.2 log2，抗体合格率为66.67%，30日龄加强免疫后14～70 d（出 栏），HI效价平均值为8.0～9.0 log2，抗体合格率为100%；首免后21 d，免疫鸡群H7亚型HI抗体效价平均值为7.5 log2，抗体合格率为100%，30日龄加强免疫后14～70 d（出栏），HI效价平均值为8.2～9.0 log2，抗体合格率为100%（图1）。

图1 鸡免疫抗体HI效价变化

2.2.2 免疫鸭群的HI抗体水平 试验结果显示：首免后21 d，免疫鸭群H5亚型HI抗体效价平均值为5.1 log2，抗体合格率为86.67%，首免后32 d，HI效价平均值为6.1 log2，抗体合格率为100%；首免后21 d，免疫鸭群H7亚型HI抗体效价平均值为5.6 log2，抗体合格率为100%，首免后32 d，HI效价平均值为6.4 log2，抗体合格率为100%（图2）。

图2 鸭免疫抗体HI效价变化

2.2.3 免疫鹅群的HI抗体水平 试验结果显示，首免后21 d，免疫鹅群H5亚型HI抗体效价平均值为3.9 log2，抗体合格率为53.33%，50日龄加强免疫后14～70 d（出栏），HI效价平均值为7.6～8.5 log2，抗体合格率为100%；首免后21 d，免疫鹅群H7亚型HI抗体效价平均值为5.2 log2，抗体合格率为100%，50日龄加强免疫后14～ d至70 d（出栏），HI效价均值为7.7～9.3 log2，抗体合格率为100%（图3）。

图3 鹅免疫抗体HI效价变化

2.3 病原检测情况

采集的所有咽肛拭子样品中，均未检出H5、H7亚型流感病毒核酸阳性。

2.4 免疫禽群临床情况

免疫后所有禽群采食量均正常，精神状况良好，注射部位无异常，没有出现发病死亡情况。

3 分析与讨论

“H5+H7”二价灭活疫苗的全面免疫是当前防控H7N9流感的主要措施和关键环节。2017年3月以来，湖南、陕西、天津、内蒙古等地相继发生了家禽H7N9流感疫情。为有效控制疫情发生，农业部决定开展H7N9流感全面免疫。本研究表明，“H5+H7”二价灭活疫苗能够对当前流行毒株产生良好的抗体反应，具有较强的抗原针对性，能抵御病毒攻击，具有较好的免疫保护效果，同时无免疫副反应，疫苗安全有效。

母源抗体的作用具有特异性和选择性，可以保护雏鸡免受特定病原体的攻击。但过高的母源抗体对雏鸡初次免疫反应的影响也很大。本试验发现，9日龄（首免日龄）肉鸡的H5母源抗体效价较高，其几何均值为7.3 log2，免疫后H5抗体效价均值急剧下降，其原因可能是母源抗体中和了疫苗中的抗原，因而可能造成H5N1保护的真空期。为尽量减少或避免母源抗体影响，建议定期检测雏鸡母源抗体，根据雏鸡体内母源抗体水平确定首免时间，优化免疫程序。

本试验发现，鸡群在首免后21d均达到了较高的抗体效价（H5N1 Re-8株、H7N9 Re-1株抗体效价平均值均大于4 log2），到达了农业部要求的标准。二次免疫后抗体平均值均明显高于一次免疫，说明加强免疫效果明显。鹅群首免后21 d 的H7抗体效价平均值大于4 log2，达到了农业部的标准，但H5抗体效价平均值小于4 log2，未达到农业部标准。二次免疫后的H5和H7抗体平均值均明显高于一次免疫，且均有较高的抗体效价（抗体效价平均值大于4 log2），说明加强免疫效果明显。这与金大春等[5]、张济培等[6]研究的“禽流感疫苗2次免疫的免疫效果较好”的结论一致。

群体免疫抗体合格率是衡量免疫质量、预警重大疫病的指标之一。研究表明，鸡、鹅首免后21 d，群体H5亚型免疫抗体合格率低于70%的农业部标准，群体免疫不合格，达不到免疫保护要求，应加强免疫。这也与杨泽林[7]的研究结论一致。

4 结论

本研究以田间试验方式，对常规养殖的肉鸡（江村黄鸡）、樱桃谷白鸭、黑棕鹅各120只，按照预定的免疫程序进行“H5+H7”二价灭活疫苗免疫，定期采集血清测定抗体效价，评估该疫苗的免疫效果。试验结果显示：首免后21 d，鸡群和鹅群的H7亚型抗体合格率均大于70%，H5抗体合格率均低于70%，但二免后的H5和H7抗体合格率均大于70%；鸭群首免后21d的H5和H7抗体合格率均大于70%。本试验结果表明，“H5+H7”二价灭活疫苗的安全性和免疫效果较好，但对于生长周期超过70 d的家禽，一次免疫，不能对这两种病毒同时提供保护，应免疫两次。