猎豹狮弓蛔虫线粒体cox1基因的序列测定及系统发育分析

李向勇，靳元春，聂 瑜，粟玉刚，唐春华，李 芬

（1.长沙生态动物园，湖南长沙 410118；2. 湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；3. 长沙市动物卫生监督所，湖南长沙 410013；4. 长沙市望城区动物卫生监督所，湖南长沙 410200）

狮弓蛔虫（Toxascaris leonina）属于蛔目（Ascaridida）蛔科（Ascaridae）弓蛔属（Toxascaris），是猫科、犬科食肉动物（如虎、猎豹、猞猁、狼等）中较为常见的胃肠道寄生虫[1]。狮弓蛔虫可寄生于猎豹的胃部和肠部，掠夺猎豹的营养，影响其营养代谢，易引发胃肠炎、肠梗阻塞等疾病，严重时可导致感染动物死亡[2]。其幼虫亦可感染人类，引发宿主胃肠道机械性损伤，属于人兽共患寄生虫[3-4]。另外，狮弓蛔虫属于土源性寄生虫，其虫卵可在土壤里存活数十日，易造成对宿主的反复感染，给我国珍稀野生动物保护工作带来了极大影响与危害[5]。

传统的寄生虫种类鉴定以形态学特征为主要依据。但这种手段主观性较大、周期性较长，且难以对形态相似虫种进行准确鉴别，因此单纯的形态学鉴定法具有很大局限性。随着分子生物学的发展，选择合适的基因片段作为标记，可以更好地探究寄生虫的遗传变异情况。线粒体DNA（Mitochondria DNA）是胞核外环状遗传物质，与核基因相比具有分子量小、结构简单、进化速率快、缺少重组等诸多特征[6]。此外，由于线粒体基因组序列容易测定，且具有较高的突变率，所以特别适合作为遗传学研究的有效遗传标记[7]，目前已被许多学者用于多种寄生虫的种间和种内遗传变异关系研究[8-10]。本研究以从湖南省长沙市生态动物园猎豹体内采集的14条狮弓蛔虫为研究对象，对其线粒体细胞色素c氧化酶I亚基基因（cox1）部分序列（pcox1）并进行扩增、克隆和序列分析，从而明确该基因序列能否成为狮弓蛔虫理想的种间遗传标记。

1 材料与方法

1.1 虫体样品

14条狮弓蛔虫（CS1～14）样品：采自湖南省长沙市生态动物园的猎豹粪便；单个样品经生理盐水冲洗后，保存于70%酒精中。

1.2 主要试剂

DNA抽提试剂盒Wizard DNA Clean-up System、pGEM-T Easy载体试剂盒、感受态细胞JM 109：Promega公司产品；蛋白酶K：Merk公司产品；Taq DNA聚合酶、PCR试剂（Buffer、MgCl2、dNTPs等）、DL2000 DNA Marker：大连宝生物公司产品。

1.3 样品DNA制备

将每个成虫截取虫体尾部小部分（1～2 cm），用双蒸水反复吹打冲洗3次后，分别放入1.5 mL的灭菌离心管中；用灭菌微型剪刀，将虫体组织剪碎，分别加入 30 μL 蛋白酶 K（50 μg/μL）和 270 μL SDS裂解液，混匀后置于55 ℃恒温培养箱中反应15～18 h，每隔1～2 h 震荡1次。消化完全后，用Promega公司的DNA抽提试剂盒提取虫体 DNA；将提取的DNA样品置于−20 ℃条件下保存。

1.4 PCR扩增

用文献[11]报道的保守引物JB3和JB4.5扩增

线粒体pcox1。其核苷酸序列如下：

JB3：5´-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT -3´（24 bp）；

JB4.5：5´- TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3´（24 bp）

引物由上海生工生物科技有限公司合成。扩增体系为 25μL：ddH2O 16.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，上下游引物（50 pmol/μL）各 0.5 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.25 μL，模板 DNA 1.0 μL。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性15 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。取5 µL PCR产物在1% TBE琼脂糖凝胶电泳。

1.5 扩增片段克隆及筛选

以OMEGA Bio-Tek公司的DNA胶回收试剂盒，对所扩增片段进行纯化；将纯化产物连接到pGEM T Easy载体上；将连接产物转化至感受态细胞 JM 109中，在含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上，无菌挑选白色单菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定，筛选获得阳性克隆。

1.6 cox1基因部分序列测定及进化分析

将鉴定为阳性的重组菌送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，并将测序结果用DNA Star软件进行分析。从GenBank上下载具有代表性的其他线虫的cox1序列，用Clustal X 2.0软件，对获得的cox1序列进行相似性比对和种系发育分析。以绵羊夏柏特线虫（Chabertia ovina）作为外群，用Phy ML 3.0程序中的最大似然树法（ML），使用经过筛选获得的最佳建树模型GTR，经过100次bootstrap推演后，用Tree View 1.65程序绘制种系发育关系树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

14个样品均扩增出约400 bp的片段，与预期pcox1目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性。（图1）

图1 猎豹狮弓蛔虫样品cox1序列PCR产物电泳图

2.2 测序结果及分析

扩增产物测序结果显示：14个猎豹狮弓蛔虫样品pcox1碱基序列长度均为415 bp，剔除引物后，均得到367的序列；14个样品pcox1序列的A+T含量（65.94%～66.21%）明显高于G+C含量（33.78%～34.06%）。对14个样品的pcox1序列进行分析比较发现，猎豹狮弓蛔虫cox1基因序列共有10个碱基发生变异，变异率为0～0.3%（表1）。将获得的样品序列与GenBank登录号上发表的猫科动物东北虎、华南虎、猞猁（登录号分别为JF780947、JF780950、JF780951）的相应序列进行比较分析，发现cox1基因变异率为1.4%～4.1%。与犬科动物狐狸、狼、犬（登录号分别为KX963448、JF780946、KC293930）的相应序列进行比较，发现cox1基因变异率为5.3%～6.8%。对蛔目线虫的cox1基因序列进行种间分析发现，猎豹狮弓蛔虫cox1序列与其他蛔虫种存在较大差异，变异率为9.7%～21.4%。

表1 猎豹狮弓蛔虫mtDNA cox1序列变异位点

2.3 cox1基因序列系统发生树

以绵羊夏柏特线虫为外群，通过Phy ML 3.0程序中的ML法，构建了种系发育树（图 2），发现狮弓蛔虫可分为两个分支：14个猎豹狮弓蛔虫分离株与GenBank中收录的东北虎、华南虎、猞猁（猫科动物）的狮弓蛔虫参考株位于同一分支，GenBank中收录的狼和犬（犬科动物）狮弓蛔虫参考株位于另一分支。猎豹狮弓蛔虫所属分支与其它蛔目线虫所属分支相隔较远，得到了很好的区别。

图2 基于pcox1基因序列以ML法构建的猎豹狮弓蛔虫系统发育树

3 讨论

准确鉴定寄生虫种类是从事寄生虫研究的重要科学问题之一，对防制寄生虫病具有重要意义。传统的寄生虫分类主要根据形态学特征进行。但随着时间的推移和生物种群的进化，形态学鉴定的局限性愈加明显，如对近缘种而言，很难从形态学上对寄生虫进行准确区分。随着分子生物学的发展，选择合适的基因作为标记，可以更好地探究寄生虫的遗传变异情况，从而为此问题的解决开辟了新途径。线粒体基因作为一种核外遗传物质，具有分子量小，很少发生基因重组，基本上为母系遗传，突变率高等特点，十分适合作为分子标记进行生物分类和种系发育方面的研究[12-14]。其中，cox1是线粒体基因组中进化速率较慢的，目前已被许多学者作为分子标记应用于寄生虫的分类鉴定[15-17]。

本研究对来自湖南省长沙市生态动物园的猎豹狮弓蛔虫线粒体pcox1基因序列进行了遗传变异分析。研究结果显示，来自不同宿主的狮弓蛔虫分离株之间的线粒体cox1基因序列差异性均小于6.8%，狮弓蛔虫与其他相关蛔目线虫相应序列的差异性均大于9.7%，即种间差异明显大于种内变异，说明cox1基因可以作为种间遗传标记应用于猎豹狮弓蛔虫的种间鉴定。然而，不同宿主的狮弓蛔虫分离株cox1基因序列差异性达6.8%，说明狮弓蛔虫也许存在隐藏种，但是需要更多的数据去证实。采用ML法构建的进化树显示，14个猎豹狮弓蛔虫分离株同GenBank中收录的东北虎、华南虎、猞猁（猫科动物）的狮弓蛔虫参考株位于同一分支，与GenBank中收录的狼和犬（犬科动物）狮弓蛔虫参考株关系最近，两者共同形成一个大分支，且与其他蛔目线虫所属分支相隔较远，因而得到了很好的鉴别。这一结论与宋美冉等[18]对华南虎狮弓蛔虫三种线粒体基因的遗传进化分析所得结论相符。本试验为猎豹狮弓蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查工作奠定了基础。