一起中华蜜蜂批量中毒死亡的紧急流行病学调查

陈裕华，甘兆年，何日文，蔡一凡，张海明，李 印，沈 丹

（1. 广州市动物卫生监督所，广东广州 510440；2. 广州市农业局，广东广州 510440；3. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

施用化学农药是当前农作物病虫害防治的主要手段[1]。近年来，随着施用化学农药数量和范围的日益扩大，在消灭有害昆虫的同时，对于蜜蜂等授粉昆虫的危害也日趋严重[2-3]。蜜蜂农药中毒又称化学中毒，是养蜂生产中存在的一个严重问题。蜜蜂中毒后大多情况下会出现死亡。其中，外勤蜂大多死于田间，采集蜂带回毒物于箱内后，可毒死蜂箱内的蜜蜂幼虫及青年工蜂。中毒的蜂群群势大多快速下降，甚至出现全群死亡[4]。

2018年3月13日，广东省广州市花都区畜牧兽医部门接到某荔枝果场内蜂农报告，称自2018年2月7日起陆续出现中华蜜蜂批量死亡情况。该荔枝果场内共有中华蜜蜂680群，截至2018年3月13日，已有430群的采集蜂、内勤蜂或新出房幼蜂出现批量死亡，蜂群袭击率为63.24%。检疫人员按照《蜜蜂检疫规程》（农医发〔2010〕41号）相关要求，在现场展开了问询调查和现场查看，并委托广东省生物资源应用研究所蜜蜂与蜂产品研发中心实验室对《蜜蜂检疫规程》中的5种常见蜜蜂疫病进行病原学镜检和PCR扩增检测。另外，委托广州市农产品质量安全监督所，对该荔枝果场内的死亡蜜蜂、蜂蜜和花粉，以及周围菜场的蔬菜样本进行农药残留检测，查找引起中华蜜蜂批量死亡的原因。

1 方法

1.1 病例定义

1.1.1 疑似病例 2018年1月1日至4月5日，广州市花都区出现死亡数量异常增多的蜂群（蜂群中个体死亡数量超过30%）。

1.1.2 确诊病例 经实验室检测确定为农药含量超标的疑似病例。

1.2 现场调查

通过问询蜂农，了解该荔枝果场内近期有无使用农药史，以及该果场周围的农作物种植情况；同时对该果场内所有蜂群的来源及用药史进行问询，并检查蜂群临床表现。

1.3 蜜蜂疫病的病原学镜检

对美洲幼虫腐臭病，参照Graaf等[5]报道的方法；对欧洲幼虫腐臭病，参照Forsgren等[6]报道的方法；对蜜蜂孢子虫病，参照Fries等[7]报道的方法；对蜜蜂白垩病，参照Aronstein等[8]报道的方法。在显微镜下进行检查。

蜜蜂蜂螨病：对蜜蜂幼虫，从2个以上子脾中随机抽取50只蜂蛹，在解剖镜下（或其它方式）逐个检查蜂蛹体表有无蜂螨寄生；对成年工蜂，随机抽取5群蜜蜂，从每个蜂群中随机抽取50只成年工蜂，置于50 mL离心管内，再加入40 mL 75%酒精（图1-A），涡旋振荡30 s后，逐一挑出所有成年工蜂，检查成年工蜂的蜂螨寄生情况（图1-B）。

图1 实验室检测蜜蜂成年工蜂的大小蜂螨寄生情况

1.4 蜜蜂疫病的PCR扩增检测

PCR引物设计参照Graaf等[5]和Forsgren等[6]的报道，引物均由大连宝生物工程有限公司合成。利用E.Z.N.A.® Insect DNA Kit，提取幼虫或成年工蜂的组织DNA，以美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病病原的特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增体系均为：2×PCR Master Mix 12.5 µL，10 μmol/L 的上下游引物各 1.0 µL，DNA 模板 2.0 µL，再补足灭菌ddH2O至总体积25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃变性3 min，35个循环（94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。每次扩增反应均设置阴性对照，且试验重复3次以上。

1.5 蜂群及周围蔬菜样本的农药残留检测

委托广州市农产品质量安全监督所，检测该荔枝果场内6处放蜂点的新死亡蜜蜂、死亡较久蜜蜂、蜂蜜和花粉各1份，周边村民种植的结球甘蓝2份。检测项目为甲胺磷、氯菊酯、氯氰菊酯、啶虫脒、哒螨灵、苯醚甲环唑、嘧霉胺、灭蝇胺、甲霜灵、霜霉威、多效唑、氯吡脲、氯虫苯甲酰胺、醚菊酯、虫酰肼、吡唑醚菌酯等72种农药残留。

1.6 数据分析

运用Excel 2010软件，对调查数据进行分析，并对此事件进行损失估算。

2 结果与分析

2.1 放蜂场地的空间分布

经 了 解， 该 荔 枝 果 场 位 于 N23°29′5″，E113°21′59″，海拔50 m，周围多为住宅小区和鱼塘。果场内共有6处放蜂点，分别饲养86、71、131、104、128和160群中华蜜蜂，分属于6户蜂农个体户。蜂场周边3 km范围内有1个蔬菜种植基地，距蜂场约1.6 km（图2）。

图2 放蜂场地位置及空间分布

2.2 蜂群受害情况

由于蜂农没有详细记录每日蜂群受害情况，因此无法绘制详细的流行曲线，只能根据6个蜂农的回忆，以7 d（1周）为时间段，绘制了蜂群受害流行曲线（图3）。

图3 蜂群受害流行曲线

经统计，该荔枝果场内共有中华蜜蜂680群，其中430群出现采集蜂、内勤蜂或新出房幼蜂批量死亡情况，蜂群袭击率为63.24%。

2.3 菜场、荔枝果场及蜂农用药情况

经了解，距该荔枝果场约1.6 km处的菜场以生产叶菜类蔬菜为主，主要品种有菜心、小白菜、花椰菜、油麦菜和结球甘蓝等。从2018年1月起，该菜场陆续有零星使用农药的情况，而近3个月内，该荔枝果场及蜂农均未有使用农药或蜂药的情况。

2.4 蜂群临床检查情况

2.4.1 箱外观察 多数巢门口均有死蜂。死亡较久的蜜蜂中，有的舌已吐出，有的蜷着身体，但未发现有爬蜂或翅残缺不全的幼蜂。

2.4.2 箱内观察 随机抽取5群蜜蜂，依次打开蜂箱盖、副盖，发现巢脾、巢框、箱壁和箱底的蜜蜂无异常行为；提取子脾，发现子脾上卵虫排列整齐、色泽正常。

2.5 蜜蜂疫病的病原学镜检

2.5.1 美洲和欧洲幼虫腐臭病 本次抽检的5个蜜蜂幼虫样本中，均未发现有革兰氏阳性的游离状杆菌芽孢（图4-A），以及0.5 μm×1.0 μm，革兰氏阳性的单个、短链或呈簇状排列的披针形球菌（图4-B），表明抽检样本中无美洲和欧洲幼虫腐臭病病原。

2.5.2 蜜蜂孢子虫病 本次抽检的5个蜜蜂成年工蜂肠道样本中，均未发现有卵圆近米粒形、边缘灰暗的蜜蜂微孢子虫，说明镜检样本中无蜜蜂孢子虫病病原。

2.5.3 蜜蜂白垩病 此次抽查的5箱蜂群中，均未发现有白垩病状虫尸，显微镜下亦未发现白色棉絮菌丝和充满孢子球的子囊，说明样本中无蜜蜂白垩病病原。

2.5.4 蜜蜂蜂螨病 现场及实验室检查发现，本次抽检的50个蜂蛹和所有成年工蜂中，均未有大小蜂螨寄生情况。

2.6 蜜蜂疫病病原的PCR扩增检测

PCR扩增反应后的琼脂糖凝胶电泳结果见图5。从图5中可以看出，本次抽检的5个蜜蜂幼虫DNA样本中，美洲幼虫腐臭病（图5-A）和欧洲幼虫腐臭病（图5-B）的PCR扩增检测结果皆为阴性，表明抽检样本中无美洲和欧洲幼虫腐臭病病原。

2.7 蜂群及周围蔬菜样本的农药残留检测

图5 美洲和欧洲幼虫腐臭病的PCR扩增检测结果

广州市农产品质量安全监督所的检测报告显示，新死亡蜜蜂和死亡较久蜜蜂样本中均可检出吡唑醚菌酯和哒螨灵这两种农药，而蜂蜜、蜂花粉和结球甘蓝样本中均无农药残留检出。其中，新死亡和死亡较久蜜蜂样本中的吡唑醚菌酯检测值分别为0.007 8 mg/kg和0.019 mg/kg，而新死亡和死亡较久蜜蜂样本中的哒螨灵检测值分别为0.004 5 mg/kg和0.009 9 mg/kg。

3 损失估算

按受害的430群中华蜜蜂中，每群损失1脾，100元/脾（流蜜期的市价）计算，此次事件造成直接经济损失约为43 000元；按1个荔枝流蜜期，每脾中华蜜蜂能产蜜2～3 kg，80元/kg（荔枝蜜的零售价）估算，此次蜜蜂批量死亡造成间接经济损失为68 800～103 200元。

4 讨论

依据《蜜蜂检疫规程》（农医发〔2010〕41号），经过现场调查、蜜蜂疫病的病原学镜检和蜜蜂疫病的PCR扩增检测，证明此次蜜蜂批量死亡并非《蜜蜂检疫规程》中的五种常见蜜蜂检疫性病害导致的。

蔬菜基地2018年1月初开始不间断使用农药，2月初油菜花盛开，而2月7日蜜蜂大量死亡，蜂群出现大面积受害，这说明蜜蜂批量死亡与农药使用在时间上存在很强的关联性。且蜂农种植的荔枝树3月18日开花后，蜂群不需要远距离飞行至蔬菜基地采蜜，蜜蜂死亡数量和蜂群受害程度急剧下降，也说明蜜蜂批量死亡与蔬菜基地使用农药有关。

吡唑醚菌酯和哒螨灵是当前在蔬菜和水果生产中均可以使用的农药[9-10]。其中，吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）是兼具吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，目前已用于100多种作物，仅次于嘧菌酯，是全球第二大杀菌剂[11]。当前研究表明，吡唑醚菌酯施药1、3、7和15 d后，对蜜蜂的死亡率与清水对照组间无显著差异，说明吡唑醚菌酯对蜜蜂是安全的，不会引发蜜蜂的农药中毒[12]。

哒螨灵（Pyridaben）是一种新型高效、广谱、低毒的杀螨杀虫剂，主要通过抑制肌肉组织、神经组织和电子传递系统染色体I中谷氨酸脱氢酶的合成，从而抑制害螨的呼吸代谢[13]。其杀螨特性为：对害螨具有很强的触杀作用，速效性好，害螨在接触药液1 h内即被麻痹击倒，停止爬行或危害；持效期较长，在幼螨及第一若螨期使用，一般药效期可达1个月，甚至达50 d[14]。据何杏等[15]报道，20%的哒螨灵可湿性粉剂对中华蜜蜂的半致死浓度（LC50）为3.072 mg/L，对蜜蜂来说为高毒。本次中华蜜蜂批量死亡事件中的新死亡蜜蜂和死亡较久蜜蜂样本中均含有一定浓度的哒螨灵残留，再结合死亡较久蜜蜂“有的舌已吐出，有的卷着身体”这一临床表现，推断引起蜜蜂批量死亡的可能原因为哒螨灵等农药引起的蜜蜂中毒。

避免蜜蜂农药中毒的关键是做好预防[4，16]。主要预防措施有：①周边农户施用农药的时机应与蜜蜂采蜜时间错开，在花期施用农药，施药农户应提前1周左右通知周边5 km内的养蜂者。②根据施药情况，对蜂群采取保护措施。用布将蜂箱盖上，暂时关闭巢门，但要给蜜蜂通风和喂水。对施用残留期长或毒性大的施药区，应尽快把蜂场撤离到5 km以外的安全区。③施用农药尽量采取统一行动，杜绝零星用药，在植物开花期施药应选择蜜蜂出巢前或晚间施药最安全。④严禁蜂农使用喷过农药的喷雾器喷蜂，不用装过农药的车厢装运蜂群，禁止在有农药污染水源附近放蜂。

5 结论

该事件经现场调查和实验室检测，最终确定为哒螨灵等农药引起的蜜蜂中毒，通过分析和排查可能的病因，最终认定是由距蜂场约1.6 km的蔬菜种植基地使用农药导致的。因此，要做好蜜蜂农药中毒的预防工作，采取相应措施，防止农药中毒事件发生，避免出现较大经济损失。