高效液相色谱法同时测定人参药材中的6种人参皂苷含量

商晓慧 朱亚楠 叶冠

摘 要 目的：参照全球主要国家药典的相关内容，应用高效液相色谱法建立更趋简便、实用的人参皂苷含量测定方法。方法：采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm）；流动相为0.025%磷酸溶液-乙腈，梯度洗脱；流速0.9 ml/min；检测波长203 nm。对10批市售人参药材中的6种人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd的含量进行测定。结果：可同时测定6种人参皂苷含量。10批市售人参药材中的6种人参皂苷含量的差异较大。结论：本方法专属性强，且测定结果准确、可靠，可用作人参药材质量标准中人参皂苷含量的测定方法。

关键词 人参 人参皂苷 高效液相色谱法 含量测定

中图分类号：R927.2； R284.1 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）13-0072-04

SHANG Xiaohui**， ZHU Yanan， YE Guan***

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the determination of six ginsenosides on the basis of ChP 2015， USP38-NF33， EP8.0， BP 2013 and JP17. Methods： The contents of six ginsenosides in ten samples sold in market were determined by HPLC on a ZORBAX Eclipse Plus C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5.0 mm） with a mobile phase of acetonitrile-0.025% of phosphoric acid solution （adjusted to pH 2 with phosphoric acid） at the flow rate of 0.9 ml/min and the detected UV wavelength of 203 nm. Results： The contents of six ginsenosides including Rg1， Re， Rf， Rb1， Rb2 and Rd in the ten samples could be simultaneously determined and there were significant differences among them. Conclusion： This method is simple， rapid and repeatable with good specificity， so it can be used for quality control of Panax ginseng.

KEY WORDS Panax ginseng； ginsenosides； HPLC； content determination

人参（Panax ginseng C. A. Mey.）为五加科植物人参的干燥的根和根茎，具有“百草之王”的美誉，具有补益脾肺、生津养血、安神益智等多种功效[1]，多用于大补元气。现代药理研究表明，人参由于其多成分、多靶点的作用，具有改善心血管循环、提高免疫力、延缓衰老和抗肿瘤等多种药理活性[2-5]。

人参具有较高的保健、药用价值，在全球范围内得到了广泛应用。目前，全球主要国家药典中均收载有人参药材的质量标准，且多以人参皂苷Rg1、Rb1和Re的含量为指标进行质量控制。

为了更好地控制人参药材质量，笔者等在参照各主要国家药典相关内容、特别是《2015美国药典-国家处方集》中西洋参质量标准的基础上，应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）建立了可同时测定人参药材中6种主要人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法，为人参药材企业内控标准的建立提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱系统（美国Agilent公司生产）；乙腈（色谱纯）、磷酸（分析纯）、水（超纯水）。

10批市售人参药材（经笔者之一叶冠鉴定为人参的干燥根，样品保存在笔者所在研究院的样本库中）。

对照品人参皂苷Rg1（批号：110703-201230）、Re（批号：110754-201525）、Rf（批号：111719-201505）、Rb1（批号：110704-201424）、Rb2（批号：111715-201203）和Rd（批号：111818-201302）均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法及结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取适量人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd，甲醇定容后得浓度分别为2 620、2 250、1 200、3 340、1 610和1 420 μg/ml的对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液制备

方法1：取供试品粉末（过4号筛）约3 g，精密称定后溶于150 ml三氯甲烷中，采用索氏提取法加热回流3 h，弃三氯甲烷液，殘渣待溶剂挥发后移入250 ml锥形瓶中，加150 ml水饱和正丁醇，超声处理90 min，过滤。取滤液125 ml，蒸干，残渣以甲醇溶解并移至25 ml量瓶中，定容，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

方法2：取供试品粉末（过4号筛）约3 g，精密称定后溶于150 ml甲醇中，超声处理90 min，过滤。滤液浓缩至25 ml，定容，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

对方法1所得供试品溶液进行HPLC测定，算得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积分别为982.39、595.27、263.14、452.23、122.08和57.19；对方法2所得供试品溶液进行HPLC测定，算得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积分别为837.65、502.76、168.33、321.98、98.56和36.23。使用方法2所得供试品溶液测得的人参皂苷含量偏低，且色谱峰的峰形较差。因此，本研究使用方法1制得的供试品溶液。

2.3 色谱条件及系统适用性试验

采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm），以0.025%磷酸溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱（0 ～ 35 min，19%乙腈；35 ～ 55 min，19% ～ 29%乙腈；55 ～ 70 min，29%乙腈；70 ～ 100 min，29% ～ 40%乙腈），流速0.9 ml/min，柱温35 ℃，进样量10 μl，检测波长203 nm。

在上述色谱条件下进行HPLC测定，对照品溶液和人参药材样品溶液的色谱图见图1。从图1可知，各人参皂苷色谱峰的峰形、分离度均良好，无干扰峰，表明系统的适用性良好。

2.4 线性关系考察

将6种人参皂苷的对照品溶液分别稀释5、10、20、50、80和100倍，以0.22 μm滤膜过滤后再分别吸取10μl进行HPLC测定。以浓度为横坐标（x）、色谱峰的峰面积为纵坐标（y）绘制各人参皂苷成分的标准曲线，线性回归后得回归方程，结果见表1。从表1可知，各人参皂苷成分在各自线性范围内的线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取由“修正”人参制得的供试品溶液，连续进样6次进行HPLC测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积，它们的RSD分别为2.44%、2.48%、1.15%、2.81%、1.67%和2.23%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取“秘参堂”人参粉末6份，分别为3.032 4、3.011 7、3.039 8、3.020 3、3.023 4和3.002 5 g，按“2.2”项下方法1制备供试品溶液，进样进行HPLC测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积，它们的平均含量分别为2.080、1.731、0.498、1.093、0.331和0.157 mg/g，RSD分别为1.38%、1.61%、1.17%、1.96%、1.38%和1.94%，表明方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取由“修正”人参制得的供试品溶液并分别于制备后0、2、4、8、12和24 h进样进行HPLC测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积，它们的RSD分别为2.25%、2.02%、1.54%、3.62%、2.83%和2.14%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的人参粉末6份约各1.01 g，加入一定量的对照品溶液，按“2.2”项下方法1制备供试品溶液，进样进行HPLC测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积，然后采用外标法计算加样回收率。

加样回收率（%）=（C-A）/B×100%

其中，A为供试品所含被测成分量，B为加入的对照品量，C为实测值。

各人参皂苷的平均加样回收率和RSD见表2。

2.9 耐用性试验

考察不同色谱柱温（25、30和35 ℃）条件下进行HPLC测定时各人参皂苷色谱峰峰面积的变化情况，算得的各人参皂苷色谱峰的峰面积和RSD见表3。

2.10 样品含量测定结果

分别取10批市售人参药材，按“2.2”项下方法1制备供试品溶液，进样进行HPLC测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色谱峰的峰面积，然后采用外标法计算它们在人参药材中的含量，结果见表4。

由表4可见，10批市售人参药材中的6种人参皂苷含量及合计含量差异较大，其中Rg1含量范围在0.139 ～0.244 g/100 g间；Re含量范围在0.124 ～ 0.190 g/100 g间；Rf含量范围在0.030 ～ 0.061 g/100 g间；Rb1含量范围在0.109 ～ 0.139 g/100 g间；Rb2含量范围在0.031 ～ 0.076 g/100 g间；Rd含量范围在0.005 ～ 0.042 g/100 g间。6种人参皂苷的合计含量范围在0.463 ～ 0.627 g/100 g间。

3 讨论

人参是名贵中药材，应用广泛。2012年卫生部發文公布批准人工种植的人参为新资源食品，明确了≤5年的人工种植人参在我国可用于食品的生产与加工。但市售的不同来源人参的活性成分含量差异较大[6]，为确保成品品质的稳定，有必要对人参药材的质量进行更全面的控制。

全球主要国家药典均以人参皂苷Rg1、Rb1和Re等的含量对人参药材进行质量控制。《2015美国药典-国家处方集》中规定，西洋参干药材中的6种人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd的总含量不得<4.0%。本研究参照全球主要国家药典的相关内容，应用HPLC建立可同时测定人参药材中6种主要人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法，以用于更全面地控制人参药材的质量。

《2015美国药典-国家处方集》西洋参质量标准中采用3 μm的色谱柱填料测定6种人参皂苷含量，对实验室设备条件的要求很高，难以用作生产企业的常规质量检查手段。《欧洲药典8.0》和《英国药典2013》中采用5 μm的色谱柱填料测定人参皂苷，但方法的专属性不好。本研究采用常规的5 μm色谱柱，通用性好，可同时对人参药材中6种主要人参皂苷进行含量测定。

食品開发注重色、香、味、形。用作食品原料的人参药材，其感官指标要求具有人参特有的香气以及味甘、微苦，但缺乏量化标准。本研究在人参药材企业内控质量标准的建立过程中，通过对市售10批人参药材进行感官评审、人参皂苷含量测定等系统研究发现，人参药材的滋味与本研究HPLC测定方法测得的6种人参皂苷的总含量呈正相关关系，但与应用紫外-可见分光光度计法（国家标准GB/T 19506）测得的总人参皂苷无相关性，推测原因可能是紫外-可见分光光度计法缺乏专一性，从而导致结果差异较大。因此，为保证人参相关食品的感官与功效，应建立或更新企业的人参药材内控质量标准，采用本研究建立的HPLC测定方法同时测定人参药材中的6种主要人参皂苷含量。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2015年版，一部）[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 8-9.

[2] 罗林明， 石雅宁， 姜懿纳， 等. 人参抗肿瘤作用的有效成分及其机制研究进展[J]. 中草药， 2017， 48（3）： 582-596.

[3] 孙莹莹， 刘玥， 陈可冀. 人参皂苷的心血管药理效应：进展与思考[J]. 中国科学：生命科学， 2016， 46（6）： 771-778.

[4] 陈文学， 杨铭， 于德伟， 等. 人参糖肽对糖尿病气阴两虚证大鼠降血糖作用及其机制研究[J]. 中国药学杂志， 2014， 49（21）： 1903-1907.

[5] Wong AS， Che CM， Leung KW. Recent advances in ginseng as cancer therapeutics： a functional and mechanistic overview[J]. Nat Prod Rep， 2015， 32（2）： 256-272.

[6] 李慧， 许亮， 温美佳， 等. 不同产地人参皂苷成分含量UPLC法测定及质量评价[J]. 中华中医药杂志， 2015， 30（6）： 1963-1968.