基于ITS2 DNA条形码的苞叶雪莲分子鉴定

郝豆豆，张勇群，雷 鸣，拉 多

(1.西藏自治区人民政府驻成都办事处医院，四川 成都 610000；2.西藏大学，西藏 拉萨 850000)

【研究意义】苞叶雪莲(Saussureaobvallata)是菊科、风毛菊属多年生草本植物，高20～50 cm，生长在海拔4500～5500 m的高山流石滩、石山、阴面石山[1]。产于青海、西藏、四川西部、云南西北部，其药性苦寒，具有抗炎镇痛、清热解毒、舒经活络的作用[2]，在中医中用于治疗中风、麻风、癫狂等疾病[3]。【前人的研究进展】由于苞叶雪莲生长于高原天然高辐射环境中，所以植株内可能存在天然抗辐射物质，有研究表明苞叶雪莲有明显的防辐射作用，能够改善免疫功能[4]；从苞叶雪莲中提取的木质素成分牛蒡苷元(ARC)和牛蒡苷(ARC-G)这2种化合物对由DMBA和TPA诱导产生的肿瘤有良好的抑制效应[5]；苞叶雪莲还含有丰富的K、Zn、Cu元素，其中尤以Zn、Cu远高于一般植物性食物，对生物膜脂质过氧化损害具有稳定作用。目前很多学者致力于将这些高效低毒的天然抗辐射药物运用到癌症治疗中，试图进一步改进癌症疗效[6]。【本研究切入点】风毛菊属(Saussurea)植物中做雪莲花用药的有20种以上，它们的产地和药用功效各不相同，但是市场上已形成了该属数种植物冠以“雪莲花”互用的局面，市场上出售的苞叶雪莲药材及其成方制剂的质量得不到保证，有很多为替代品[7]。雪莲花药材市场情况混乱，执行药材品质评价工作较为困难。目前该药材的鉴别有性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别和高效液相色谱等方法[8]。随着分子生物学技术的发展，DNA条形码技术很快被应用到物种鉴定中，因其能准确、快速鉴定物种，在物种鉴定中有很大优势，ITS2序列为核糖体DNA第2内转录间隔区，有足够的变异性来区分密切相关的物种[9]。【拟解决的关键问题】本文对苞叶雪莲的ITS2序列进行分析，旨在为其近缘物种建立基于ITS2的DNA条形码的鉴别方法，也为其在市场上的质量控制和安全用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

苞叶雪莲采自西藏林芝色季拉山(海拔4677 m，29°37′04″N；94°39′01″E)，苞叶雪莲由西藏大学理学院拉多教授(研究方向为植物学与植物生态学)鉴定，将样品保存在装有硅胶的自封袋里，迅速脱水，干燥保存。苞叶雪莲的近缘物种序列来源于GenBank数据库。

1.2 苞叶雪莲DNA提取、PCR扩增和测序

用高盐低pH法[10]提取苞叶雪莲总DNA；采用核基因ITS片段扩増[11]，正向引物序列为：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，反向引物序列为：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；PCR扩增程序为:94 ℃预变性5 min；进入PCR循环，94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物送到生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.3 序列比对

用Bioedit软件进行多序列比对，用DNAstar软件计算GC含量。

1.4 系统发生树构建

将全部序列用MEGA(Molecular Evolutionany Genetics Analysis)6.0软件分析，基于邻接(Neighbor Joining，NJ)法构建系统聚类树，基于K2P双参数模型利用Bootstrap法1000次重复检验各分支的支持率。

1.5 ITS2序列二级结构预测

ITS序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段即可获得ITS2间隔区序列[12]；根据Koetschan等建立的ITS2数据库(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de./)预测ITS2序列的二级结构[13]。用Image J软件计算ITS2序列二级结构的各区之间的夹角。

2 结果与分析

2.1 苞叶雪莲的ITS序列测定

用紫外分光光度计测定苞叶雪莲的浓度，为2520 μg/mL，A260/280=1.70，A260/230=1.85。说明用高盐低pH法提取的苞叶雪莲总DNA浓度高，蛋白质、糖类、小分子物质等基本去除干净，DNA的质量满足后续的分子生物实验。测序后的序列去除两端信号不稳定的序列，最终的序列长度为400 bp，GC含量( %)为58.44。去除两端的5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列，长度为217 bp。

2.2 基于ITS2序列苞叶雪莲同属样本多序列比对分析

苞叶雪莲属于风毛菊属中的珍贵野生种，对与苞叶雪莲同属的16个风毛菊属野生种(表1)的ITS2序列进行了同源比对(图1)，比对后17个风毛菊属的野生物种一致序列长度为224 bp，共有31个变异位点。苞叶雪莲、鼠麯雪兔子、雪莲花、污花风毛菊、椭圆风毛菊、显鞘风毛菊、重齿风毛菊和高山风毛菊在1～3碱基位点序列为CGC,而褐花雪莲、球花雪莲、东俄洛风毛菊、唐古特雪莲、长叶雪莲、禾叶风毛菊、柱茎风毛菊和绵头雪兔子在该位点出现缺失。在第44位，其余物种都为T，只有苞叶雪莲突变为C，此位点应是将苞叶雪莲与其他物种进行区分的一个重要位点。苞叶雪莲等风毛菊属植物有2个POLY结构(≥5个单碱基重复)，13～17位点为PloyC，94～98位点为PloyA，个别植物有变异，钻叶风毛菊第16位突变为A，绵头雪兔子第16位缺失，鼠麯雪兔子第98位突变为T。在139位点钻叶风毛菊、球花雪莲、显鞘风毛菊、柱茎风毛菊、污花风毛菊和重齿风毛菊有插入碱基事件。在第173位，其余物种均为G，只有苞叶雪莲和高山风毛菊突变为A。在其它的变异位点处，各物种分别有突变或缺失，可以将各样本区分开来。

表1 苞叶雪莲及16种其它风毛菊属野生种信息

图1 苞叶雪莲同属物种的ITS2序列比对Fig.1 ITS2 sequence alignment between Saussurea involucrata and species of the same genus

2.3 苞叶雪莲系统进化树分析

为了进一步分析利用ITS2序列对苞叶雪莲(风毛菊属)与菊科其它属之间进行系统发育分析的可能性，分析了风毛菊属(Saussurea)、牛蒡属(Arctium)、漏芦属(Rhaponticum)、红花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、蓝花矢车菊属(Cyanus)、仓木属(Atractylodes)、刺苞菊属(Carlina)、飞廉属(Carduus)、蓟属(Cirsium)共10个属30个种(表2)的进化关系。

表2 苞叶雪莲近缘物种信息

分支上的数值仅显示自展支持率≥50 %The number on the branch shows only the bootstrap value is greater than 50 %图2 苞叶雪莲系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of Saussurea involucrata

根据ITS2序列对所有样本构建NJ系统聚类树(图2)。可见17个风毛菊属野生种共同形成了单个大的分支，支持率为99 %；牛蒡属(Arctium)、蓝花矢车菊属(Cyanus)、红花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、漏芦属(Rhaponticum)与风毛菊属聚为一个大支，支持率为68 %，说明亲缘关系较近；其余的属聚为另一个大支，说明与风毛菊属亲缘关系较远；蓟属(Cirsium)聚为一支，支持率为96 %；相同属物种聚类为一小支说明分类的准确性，充分说明ITS2作为苞叶雪莲DNA条形码序列的合理性。

2.4 苞叶雪莲ITS2序列二级结构分析

选取与苞叶雪莲同属的2个物种[鼠麯雪兔子和球花雪莲(图3B、C)]与与其同科不同属的3个物种[红花、牛蒡和飞廉(图3D、E、F)]，进行二级结构比较。

分析苞叶雪莲与其同属物种的ITS2二级结构发现，2区和4区结构相同，说明是保守区域；A和B的1区结构也相同，A和C的1区结构仅仅是环与环的距离存在微小差异；A、B、C的第3区结构互不相同，表现在A与B的茎环数不同，A与C茎环距离不同；从各区夹角(表3)来看，3个物种的各区夹角均有差异，说明可以通过预测二级结构，根据物种二级结构的独特性，将其与其近缘物种进行区分。苞叶雪莲与其他不同属物种的ITS2二级结构相比较，1区和3区的茎环数量、环与环的距离及环的大小差异较大，2区和4区相对差异较小；与苞叶雪莲不同属的物种，各区夹角也有明显差异，所以二级结构能够明确区分与苞叶雪莲不同属的物种。

3 讨 论

苞叶雪莲在我国藏药材中占有重要的地位，但是由于苞叶雪莲种群更替慢，过度采挖导致物种数目越来越少，植物种群一但被破坏，很难自我恢复。苞叶雪莲在市场上得不到充足的供给，就出现了各种假冒伪劣、以次充好的替代品，药材质量得不到保证，质量监管困难重重。ITS2序列作为中药材鉴定的DNA条形码，不受植物形态特征的影响，直接从分子水平上对植物进行区分，不仅鉴定方法简单，并且鉴定准确率高，在包括植物、动物、真核微生物等生物物种鉴定领域具有独特的优势，越来越受到学者的重视[14]。

A：苞叶雪莲；B：鼠麯雪兔子；C：球花雪莲；D：红花；E：牛蒡；F：飞廉A: Saussurea involucrata; B: Saussurea gnaphalodes; C: Saussurea globosa; D: Carthamus tinctorius; E: Arctium lappa; F: Carduus nutans图3 苞叶雪莲等6种菊科野生种的ITS2序列二级结构预测Fig.3 Secondary structure prediction of ITS2 sequences of 6 wild species of Compositae

物种各区夹角(°)1234A34.39269.060112.620143.041B30.18463.939129.250137.513C35.16772.016122.082130.236D31.33960.402123.300145.456E32.90566.801113.629147.031F32.20364.344124.071139.627

注：A：苞叶雪莲；B：鼠麯雪兔子；C：球花雪莲；D：红花；E：牛蒡；F：飞廉。 Note: A:Saussureainvolucrata; B:Saussureagnaphalodes; C:Saussureaglobosa; D:Carthamustinctorius; E:Arctiumlappa; F:Carduusnutans.

4 结 论

本文将苞叶雪莲和来源于GenBank数据库样本的ITS2序列进行了分析，结果显示，苞叶雪莲与其同属和近缘属的ITS2序列组成、ITS2二级结构、分子进化树聚类这几个层面均表明，ITS2序列能够很好对物种与其近缘物种进行分子鉴定。由于GenBank数据库中集合了全球各个不同地方的研究学者所提交的研究成果，样本来源地非常广泛，所以数据具有全方位性，结果比较可靠。有研究报道，对ITS2二级结构进行分析可以解决更高级分类时多序列比对困难的问题[15-16]。总之，找到一个快速、准确的识别和鉴定植物的方法很有必要，ITS2序列作为DNA条形码可方便快捷地鉴别苞叶雪莲及其代用品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。