脑胶质瘤组织中lncRNA-LINC01116的表达变化及其意义

林树楷，李钢，周奋，刘仲海，隋建美

(1海南省第三人民医院，海南三亚 572000；2贵州医科大学附属医院)

脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，其发病率与病死率均居中枢神经系统恶性肿瘤之首[1]。脑胶质瘤的组织学亚型众多，一般可分为毛细胞星形细胞瘤、弥漫型星型细胞瘤、间变型少突星型细胞瘤、少突胶质细胞瘤、间变型少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤，而WHO则依据其恶性程度将其划分为Ⅰ～Ⅳ级[2]。近年来，虽然外科手术、放疗、化疗、辅助治疗等治疗手段不断拓展[3]，但脑胶质瘤患者的预后仍不容乐观[4]。长链非编码RNA(lncRNA)是一组非蛋白质编码RNA的统称，目前发现的lncRNA长度为20～200个核苷酸[5]。lncRNA作为一大类转录调节因子，能够通过转录干扰与染色质重塑等途径调控基因表达[6]，其中lncRNA-LINC01116已被证实在多种类型肿瘤中过表达。研究[7]发现，若用siRNA抑制前列腺癌中lncRNA-LINC01116的表达，则肿瘤细胞的增殖与疾病的进展都会受到抑制。但目前lncRNA-LINC01116在脑胶质瘤等恶性肿瘤中所起的作用尚未得到深入研究，因而也限制了其在临床上应用的拓展。本研究采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)检测脑胶质瘤组织中lncRNA-LINC01116，并分析其与脑胶质瘤临床病理特征及患者预后的关系，以求判断将其作为脑胶质瘤临床病理诊断手段和评估患者预后指标的可能性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2005年3月～2010年9月海南省第三人民医院收治的脑胶质瘤患者95例，男56例，女39例；年龄21～68岁，其中≤45岁51例、>45岁44例；无脑积水91例，有脑积水4例；病理类型为星形细胞瘤46例，胶质细胞瘤49例；肿瘤直径<4 cm 34例，≥4 cm 61例；术前KPS评分≤70分23例，>70分63例；侵犯脑叶数<2个71例，≥2个24例；病理分级Ⅰ～Ⅱ级38例，Ⅲ～Ⅳ级57例。纳入标准：①患者临床资料完整，出院随访未失访；②经病理科确诊为脑胶质瘤；③为原发性脑胶质瘤；④未合并其他恶性肿瘤；⑤术前未经放、化疗等其他抗肿瘤手段治疗；⑥未合并严重代谢性疾病；⑦术后存活期超过3个月，以排除手术原因造成的死亡。手术留取脑胶质瘤组织95例份，另选同期经颅内减压术切取的正常脑组织21例份作为对照。本研究经本院伦理协会批准，且患者及家属均知情同意。

1.2 组织中lncRNA-LINC01116检测方法 采用qRT-PCR法。将待测样本置于匀浆器中磨碎，加入TRIzol®试剂，充分裂解后加入氯仿，冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清，加入异丙醇沉淀后，75%乙醇洗涤沉淀，收集RNA沉淀，加入适量DEPC水重分溶解。利用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测提取的总RNA浓度，取OD260/OD280值在1.8～2.0的样本。利用TaKaRa RR047A PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)将提取的总RNA逆转录为cDNA，置于-80 ℃冰箱冷冻保存备用。以GADPH为内参，利用TaKaRa RR420A SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)进行qRT-PCR，以2-ΔΔCt法计算lncRNA-LINC01116的相对表达量。lncRNA-LINC01116上游引物序列：5′-CTTCTTTCCCTCCAAGTGAT-3′，下游引物序列：5′-TTAGCAAGTCAGCAAGTCCT-3′；GADPH上游引物序列：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物序列：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.3 患者预后随访 以患者术后出院为观察起点，通过电话、电子通讯与复诊相结合的手段对患者进行随访。随访截止于2017年10月，随访时间10～127个月。

2 结果

2.1 脑胶质瘤、正常组织lncRNA-LINC01116表达比较 脑胶质瘤、正常组织lncRNA-LINC01116的相对表达量分别为0.665±0.678、0.103±0.147，两者比较，P<0.05。

2.2 lncRNA-LINC01116表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系 结果见表1。由表1可知，lncRNA-LINC01116仅与脑胶质瘤患者临床病理分级有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、是否发生脑积水、病理类型、肿瘤直径、术前KPS评分、侵犯脑叶数目无关(P均>0.05)。

2.3 lncRNA-LINC01116表达与脑胶质瘤患者预后的关系 按照lncRNA-LINC01116相对表达量的平均数0.665为界，将95例患者分为低表达者41例和高表达者54例，绘制Kaplan-Meier生存曲线(见图1)；低表达者生存率为73.17%(30/41)、生存时间为(100.30±6.91)个月，高表达者生存率为31.48%(17/54)、生存时间为(43.90±5.92)个月，两者比较，P均<0.05；低表达者复发率为31.71%(13/41)，高表达者复发率为74.07%(40/54)，两者比较，P<0.05。

表1 lncRNA-LINC01116表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系

图1 脑胶质瘤患者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

脑胶质瘤属于浸润性肿瘤，肿瘤细胞可向周围正常组织渗透，与正常脑组织缺乏明确的分界，显著增加了外科手术切除的难度，这是脑胶质瘤患者生存率低、预后差的主要原因[8]。此外，脑胶质瘤组织具有持续无限复制、血管快速生成以及免疫逃逸等特性，因而具有较强的侵袭与转移能力[9]。脑胶质瘤是高度异质性肿瘤，放化疗药物难以对其进行准确定位，导致脑胶质瘤细胞对放化疗具有高度耐受性[10]。因此，从基因与细胞层面上探究脑胶质瘤的发生发展机制，可为脑胶质瘤患者的个体化治疗提供方向。

近期，Gao等[11]利用qRT-PCR技术检测到lncRNA-HOXAAS2在脑胶质瘤组织与脑胶质瘤细胞系中的表达均异常升高，抑制lncRNA-HOXAAS2表达后，脑胶质瘤细胞的增殖、转移、侵袭能力随之减弱，且脑胶质瘤组织的血管生成也受到抑制；Wang等[12]发现，lncRNA-PAR5通过影响EZH2基因表达，促进脑胶质瘤细胞的增殖与转移；lncRNA-MEG3则是通过Wnt/β-catenin途径促进脑胶质瘤细胞的增殖[13]。然而Dong等[14]却发现，抑制脑胶质瘤细胞中lncRNA-ANRIL表达，虽能减弱细胞的增殖、转移与侵袭能力，但同时能促进细胞凋亡。以上研究结果表明，不同lncRNA可能通过影响不同基因、信号通路参与脑胶质瘤细胞的增殖、转移与侵袭等过程。

据统计，人类基因组中超过90%的基因被转录为非编码RNA。lncRNA是指其中长度超过200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA参与机体内多种生理进程，如表观遗传调控、RNA降解、miRNA沉默、细胞结构与组织的构建以及蛋白质定位的调控等[15～17]。研究[18～20]表明，lncRNA异常表达与多种疾病相关，尤其是恶性肿瘤[21,22]。lncRNA-LINC01116是一段长1 058 bp的基因，位于人体染色体2q31.1[23]。研究[24]发现，lncRNA-LINC01116能够参与调控缺氧诱导的多种细胞炎症因子的表达，从而参与缺氧相关的血管内皮细胞炎症反应。而恶性肿瘤相关研究则发现，lncRNA-LINC01116能够通过影响YAP1、VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达，参与非小细胞肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生与发展[25]。

本研究显示，lncRNA-LINC01116在脑胶质瘤组织中高表达，提示lncRNA-LINC01116可促进脑胶质瘤组织的形成与发展，与lncRNA-HOXAAS2、lncRNA-PAR5以及lncRNA-MEG3等的作用类似，均呈现促癌基因作用。本文结果显示，lncRNA-LINC01116表达仅与脑胶质瘤患者病理分级相关，而与患者其他临床病理参数均无关。脑胶质瘤是一种高度异质性肿瘤，不同组织亚型的脑胶质瘤的生物学特性相差较大，且由于本研究中的样本数较少，导致并未发现lncRNA-LINC01116表达与患者年龄、性别、是否发生脑积水、病理类型、肿瘤大小、术前KPS评分以及侵犯脑叶数之间存在关联。本研究还发现，lncRNA-LINC01116表达程度低的患者，具有较高的术后生存率、较长的生存时间以及较低的复发率，提示lncRNA-LINC01116高表达可以作为脑胶质瘤患者不良预后的指标之一。

总之，lncRNA-LINC01116在脑胶质瘤组织中异常高表达，其高表达提示较高的复发概率以及较差的预后。因此对于高表达lncRNA-LINC01116的脑胶质瘤患者，建议术后结合放疗、化疗等手段辅助治疗，同时加强监测，预防复发，提高患者生存率，延长患者生存时间。