仙鹤草中齐墩果酸类皂苷的提取工艺研究①

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(1.佳木斯市中心医院药剂科，黑龙江 佳木斯 154002;2.佳木斯大学附属第一医院药剂科，黑龙江 佳木斯 154007)

0 引 言

仙鹤草在我国资源丰富，但是药用开发多处于初级阶段，集中在其化学成分及活性上，化学成分方面以小极性分子为主，极性较大的鞣质类、三萜皂苷类和黄酮苷类等研究较少，较少见到对单一化合物活性的研究；仙鹤草活性方面的研究多集中在抗肿瘤、抗氧化等，但是大多数作用机制研究还不深入，结合药效物质基础的构效关系研究亦少见，这大大限制了仙鹤草的临床应用及新药研发。

仙鹤草Agrimonia pilosa Ledeb，蔷薇科龙芽草属植物龙芽草的全草，又名马鞭草，其性平味苦涩，归心、肝经，具有收敛止血等功效，临床主要用于治疗咯血、崩漏下血、脱力劳伤等[1,2]。现代研究证明其富含多糖、三萜皂苷，黄酮，有机酸和挥发油等[3～5]。药理实验研究发现仙鹤草具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗炎和抗菌等药理活性[6]。

齐墩果酸(OleanolicAcid,OLA)，五环三萜类化合物，其结构式为：

OLA是广泛地存在于食物、医学草本植物和其他植物中，其毒性很低，生物活性丰富[7,8]：抗病毒、降血脂、降血糖和抗艾滋病毒等，药用价值较大。旨在筛选超声波提取仙鹤草中齐墩果酸类皂苷的最佳参数及其水平，最大化提取齐墩果酸，为该植物中三萜皂苷类成分的充分利用与深入的药理研究奠定实验依据。

1 仪器、材料和试剂

紫外可见分光光度计(UV757CRT型)；旋转蒸发器(RE-52A型)；恒温电热套(DRT-SX型)；电子分析天平；医用数控超声波提取器；恒温水浴锅。

仙鹤草购买于佳木斯市。

齐墩果酸标准品(金测分析技术有限公司)；冰醋酸，三氯甲烷，浓硫酸，95%乙醇，环已烷，乙酸乙酯，无水乙醇，甲醇(色谱纯)，硅胶G(薄层色谱)，未标明的均为分析纯。

2 实验方法

2.1 齐墩果酸类皂苷的含量测定

2.1.1 标准品溶液和待测溶液的配制

取齐墩果酸标准品，用甲醇制成浓度为0.2g/mL的溶液，精密移取标准溶液于具有塞比色管中，加入浓H2SO42mL，摇匀，80℃水浴加热30min，取出后放入冰浴中冷却，加入适量甲醇，定容至10 mL，即得标准品对照溶液。4℃，放置，备用。

仙鹤草各种提取液，依上述方法配制待测液。

2.1.2 最大吸收波长的确定

以H2SO4-CH3OH溶液(质量分数20%)为空白对照，于波长200-400nm之间扫描，确定最大吸收波长。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取10mL标准品溶液，减压蒸馏，然后加入20mL浓H2SO4，摇匀，水浴加热30min，冷却，精密移取待测液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6 mL，分别置于8个具塞比色管中，采用甲醇定容至10 mL，静置，以梯度浓度H2SO4-CH3OH溶液作为空白对照，于所确定的最大吸收波长处测定其吸收值，绘制标准曲线，得回归方程

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对皂苷提取的影响。

称取10g 仙鹤草粉末5份，分别加入体积分数为60%,70%,80%,95%,100%的乙醇溶液各120mL，超声波提取20min，取滤液浓缩至约50 mL，用移液管取1 mL定容至100 mL，用移液管取1 mL在最大吸收波长下测定皂苷含量(测定方法下同)。

2.2.2 料液比对皂苷提取的影响。

称取10g仙鹤草粉末5份，分别加入80,100,120,200,250 mL体积分数95%的乙醇溶液，超声提取后进行含量测定。

2.2.3 超声提取时间对皂苷提取的影响。

称取10g仙鹤草粉末5份，分别加入120mL 95%的乙醇溶液，超声提取0,15，20，25,30 min后进行含量测定。

2.2.4 提取次数对皂苷提取的影响

称取10g仙鹤草粉末4份，分别加入120mL95%的乙醇溶液，提取1次、2次、3次、4次后进行含量测定。

2.2.5 温度对皂苷提取的影响

称取10g仙鹤草粉末5份，分别加入120mL 95%的乙醇溶液，在50℃,60℃,70℃,80℃,90℃恒温水浴中超声波提取20min后进行含量测定。

2.3 正交试验

进行四因素三水平正交试验设计，通过实验确定影响超声波提取仙鹤草中齐墩果酸类皂苷的主要因素及水平。

3 实验结果

3.1 齐墩果酸溶液的标准曲线

根据设计方法，确定齐墩果酸标准溶液的回归方程为y= 41.914x(R2=0.9707)，结果见图1。皂苷标准液浓度在2～16μg/mL时呈线性关系。

图1 齐墩果酸溶液的标准曲线

图2 乙醇浓度对超声波提取齐墩果酸类皂苷的影响

图3 料液比对超声波提取齐墩果酸类皂苷的影响

3.2 单因素试验

乙醇溶液体积分数为95%时，皂苷的提取量最大，结果见图2；料液比(g：mL)达到1 1:20，皂苷提取较完全，结果见图3；提取时间为20min时，含量最大，结果见图4；提取次数为2次时，吸光值达到最大，结果见图5；温度为70℃时，吸光值达到最大值，结果见图6。

3.3 正交试验

通过正交试验可知，影响超声波提取仙鹤草中齐墩果酸类皂苷提取率的主要因素及大小顺序是D>C>B>A，即料液比、超声波提取时间、温度、乙醇浓度。其中7号试验(A3B1C3D2)提取率最大，为8.4%，实验条件为乙醇浓度100%，超声温度60℃，超声时间25 min，料液比1:12。结果见表1。

表1 正交试验结果

图4 超声时间对超声波提取齐墩果酸类皂苷的影响

图5 超声提取次数对超声波提取齐墩果酸类皂苷的影响

图6 提取温度对超声波提取齐墩果酸类皂苷的影响

4 结 语

以极性较大的皂苷类为研究对象，对仙鹤草中齐墩果酸皂苷的提取工艺进行优化筛选，旨在为深入开展其中同类皂苷类研究奠定提取方面的理论基础，为进一步完成活性及其机制研究提供物质来源。通过实验可知，仙鹤草中皂苷含量较丰富，作为药用植物具有开发价值；实验得出的以齐墩果酸为主的皂苷类化合物的提取工艺简便易行，提取率高，值得推广。