乳腺癌细胞中microRNA作用机制的系统生物学分析

谢忠伟 李普民 王进

乳腺癌是女性发病率较高的恶性肿瘤之一，病因尚未完全清楚。现在已知的乳腺癌易感基因有BRCA1和BRCA2等[1]。microRNA（miRNA）是一类内源性的约22 nt的RNA，通过结合在基因的3’UTR抑制基因的表达，大量癌症研究表明，miRNA在癌症发生过程中起到重要作用[2]。与传统的针对单个基因的研究模式不同，系统生物学的方法试图考虑到生物体内多个基因之间的交互作用，避免以偏概全的局限性，从而揭示生物系统背后复杂的机制。本研究对人乳腺上皮细胞（HMEC）和乳腺癌细胞（MCF7）采用了RNA-seq技术筛选出差异表达的miRNA和基因，结合miRNA对基因的靶向关系，构建差异miRNA与基因的调控关系，进而分析差异表达基因参与的信号通路，从系统层面上了解乳腺癌细胞中的基因调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及RNA提取

HMEC和MCF7购买于ATCC平台，细胞按照ATCC要求进行培养，用Trizol方法提取细胞中的总RNA。

1.2 文库构建与测序

测序文库的构建使用的是NEB产品（E7645S），由北京百迈客生物科技有限公司测序。

1.3 miRNA测序分析

去除测序数据中包含接头序列、质量值低于20及长度大于30、低于18的序列。利用miRDeep2（https：//github.com/rajewsky-lab/mirdeep2）软件获得成熟miRNA的表达情况，将变化倍数大于2的miRNA作为差异表达miRNA。成熟的miRNA数据下载于miRBase21（http：//www.mirbase.org/）。

1.4 基因测序分析

去除测序数据中包含接头序列、质量值低于20及长度低于30的序列。利用TopHat软件（https：//ccb.jhu.edu/software/tophat/manual.shtml）将clean reads比对到参考基因组上，再用cufflink套件（http：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/）进行差异分析，将变化倍数大于2且P值小于0.01的基因作为差异表达基因。参考基因组序列信息及基因注释文件均下载于Ensembl数据库（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/）的hg38最新版本。

1.5 miRNA与基因的调控关系构建

差异表达miRNA的靶基因预测使用Tarbase[3]。从预测结果中提取在HMEC和MCF7中差异表达且与miRNA表达变化负相关的基因。Hub基因取Top10高度值的节点。

1.6 通路富集分析

使用R包clusterProfiler（https：//github.com/GuangchuangYu/clusterProfiler）对差异miRNA调控的基因进行通路富集分析，设定P＜0.01。

2 结果

2.1 差异表达miRNA分析

MCF7相比HMEC共发现456个差异表达miRNA，其中上调表达217，下调表达239。

2.2 差异表达基因分析

MCF7相比HMEC共发现4 566个差异表达基因，其中上调表达2 710，下调表达1 856。

2.3 调控关系分析

结合差异表达miRNA的靶基因信息，获得表达变化呈负相关的348个miRNA和2 223个基因，共16 554条调控关系，构成miRNA对靶基因的调控网络，网络度分布示于图1A，接近scale-free网络。图1B是hub节点构成的子网络，hsa-miR-19a-3p与hsa-miR-30c-5p等hub miRNA在乳腺癌细胞中主要是通过靶向POU2F和CBX5等hub基因起作用。

2.4 通路富集分析

2 223个被差异miRNA调控的基因共富集到64条通路上，最显著的前5条通路分别是PI3K-Akt信号通路、人乳头状瘤病毒感染、细胞质基质粘连、癌症蛋白聚糖和MAPK信号通路。

3 讨论

图1 差异miRNA与靶基因的调控关系分析

乳腺癌作为女性发病率较高的恶性肿瘤之一，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始就一直呈现上升趋势，但是目前病因尚未完全清楚。大量研究发现，miRNA作为重要的转录后调控因子，在癌症的发生过程中起到重要的作用。系统生物学从生物系统的角度揭示复杂的机制，利用系统生物学的方法分析基因和miRNA在癌细胞中的转录活动，有助于分析癌症的发病机制。

本研究对HMEC和MCF7采用了RNA-seq技术筛选出差异表达的456个miRNA和4 566个基因，文献中被报导过的易感基因BRCA1与BRCA2[1]均显著上调，与乳腺癌密切相关的miR-221/222[4]也发生显著变化。筛选出表达变化呈负相关的348个miRNA和2 223个基因，得到在细胞中发挥重要作用的hub基因和hub miRNA。此外还构建了共16 554条调控关系，构成miRNA对靶基因的调控网络，网络度分布接近scale-free网络。通过观察hub节点构成的子网络，发现hsa-miR-19a-3p与hsa-miR-30c-5p等hub miRNA在乳腺癌细胞中主要是通过靶向POU2F和CBX5等hub基因起作用。2 223个被差异miRNA调控的基因共富集到64条通路上，最显著的前5条通路分别是PI3K-Akt信号通路、人乳头状瘤病毒感染、细胞质基质粘连、癌症蛋白聚糖和MAPK信号通路。其中，众多研究表明PI3K-Akt通路与肿瘤的耐药和转移密切相关[5]；细胞基质粘连在细胞迁移、细胞增殖、细胞分化、细胞表达的调控以及细胞生存方面发挥了不可或缺的作用[6]；蛋白聚糖成为癌症治疗的靶标和标记物[7]。hub基因中CDK6参与其中PI3k-Akt、p53等15条通路，有研究表明，CDK6一般在癌细胞中下调表达，是癌症与疾病生成的重要标记物，并且被广泛用来作为药物作用靶点[8]。

综上所述，hsa-miR-19a-3p与hsa-miR-30c-5p等hub miRNA靶向CBX5和POU2F等hub基因与乳腺癌的生成密切相关；PI3K-Akt与细胞基因粘连等通路在乳腺癌的基因调控机制中起着重要作用。