补肾壮骨颗粒对SAMP6小鼠股骨宏观结构及生物力学的影响

汤璐璐 邓伟民* 苏海容 袁人飞

1. 广东药科大学，广东 广州 510006 2. 广州军区广州总医院，广东 广州 510010 3. 广州中医药大学，广东 广州 510403

5年临床观察发现补肾壮骨颗粒可以有效缓解绝经后骨质疏松症和老年男性骨质疏松症患者疼痛的症状，提高骨矿含量和骨密度，降低骨折发生率，且无明显不良反应，价格便宜[1-2]。衰老导致的生长激素分泌不足也是引发老年男性骨质疏松的重要原因之一，文献表明生长激素可以通过调节GH/IGF-1轴刺激成骨细胞的复制和骨基质的合成，防治中老年男性骨质疏松症的发生，目前被认为是治疗骨质疏松最有前途的药物之一[3]，但研究表明rhGH的应用会引发某些副作用，且有潜在致恶性肿瘤的风险[4],价格昂贵，故对于生长激素的运用仍旧比较谨慎。本研究以快速老化雄性小鼠(senescence accelerated male mice,SAMP6)为老年男性骨质疏松模型，以生长激素为阳性对照药，分析补肾壮骨颗粒对SAMP6股骨结构及生物力学性能的影响，并探讨是否有可能替代生长激素进行对老年男性骨质疏松的治疗。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究以30只清洁级3月龄快速老化骨质疏松模型雄性小鼠(SAMP6)和10只同源正常雄性小鼠(SAMR1)为研究对象。所有动物(许可证号：SCXK-津-2015-0003)均来自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心SAM品系小鼠繁育屏障系统，国家二级动物房饲养及运动干预，终年环境维持在相对湿度55%-60%，室温23±2 ℃，每小时自动换风16次，12 h光照/12 h黑暗循环光照的条件。

1.2 方法

1.2.1药物与仪器：补肾壮骨颗粒(广州军区广州总医院，批号15K04001)主要由骨碎补、龟甲胶、鹿角胶、淫羊藿、水蛭、山药、巴戟天7味中药组成，由广州军区总医院药剂科提供。尤得盼注射用重组人生长激素(4IU(1.33 mg)/瓶，产品批号UTR15020)由(株)LG生命科学制造，购自广州军区总医院药剂科。858MiniBionix型材料测试系统(MTS;USA)，Micro-CT仪(viva CT40;SCANCO Medical AG)。

1.2.2实验分组及给药方法：SAMP6(30只)被随机平均分为模型组(MG)、中药组(CMG)和生长激素组(GHG)，每组10只，选取10只正常老化雄性小鼠(SAMR1)作为同源对照组(NG)。每天给药一次，给药剂量为临床等效剂量(补肾壮骨颗粒灌胃3.5 g/kg[5]，重组人生长激素皮下注射1μg/g)，模型组和正常组给予等量的生理盐水。每隔一周进行一次体重称量，并结合体重调整给药剂量。3个月后每组随机选取5只小鼠去眼球取血处死，取其左侧股骨，并彻底剔除软组织，用Micro-CT仪扫描测定股骨骨量，858MiniBionix型材料测试系统行股骨三点弯曲应力试验测量与分析，加载速度为5 mm/min，跨距为10 mm,股骨断裂后，用电子游标卡尺测量横截面外层长轴、外层短轴、内层长轴、内层短轴，6个月后采取同样的方法处理剩余的小鼠。

1.2.3测量指标：(1)股骨力学几何尺寸 ①骨横截面外层长轴②骨横截面外层短轴③骨横截面内层长轴④骨横截面内层短轴⑤骨横截面面积(bone)⑥骨髓腔横截面积(Marrow cavity)⑦横截面皮质骨面积(Cortical bone)。

(2)股骨力学几何量 截面惯性矩(moment of inertia)由公式(π/64)×(D14-D24)得出，极惯性矩(polar moment of inertia)由公式(π/32)×(D14-D24)得出，抗弯截面模数(Modulus of flexural)由公式(π/32)×(D14-D24)/D1得出，抗扭截面模数(Modulus of torsion)由公式(π/16)×(D14-D24)/D1得出，式中D1为股骨外径(exter-diameter，平均值)，D2为骨髓腔内径(inter-diameter，平均值)。

(3)骨量参数 用Micro-CT仪扫描测定股骨整体骨矿密度(BMD)。

(4)生物力学性能 生物力学性能指标采用858MiniBionix型材料测试系统测试得到:(1)结构力学参数：①最大载荷(max-load)②弹性载荷(elasticity load)③最大绕度(Max-winding)④最大弯矩(max- bending moment)⑤能量吸收(absorption of energy)；(2)材料力学参数：①最大应力(max-stress)②弹性应力(elastic stress)③刚性系数(coefficient of rigidity)④弹性模量(modulus of elasticity)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对体重的影响

如表1所示，与正常组相比，3个月后模型组最终体重及增重量大于正常组，差异具有显著性，6个月后模型组最终体重及增重量大于正常组，差异不具有显著性；与模型组比较，3个月与6个月后生长激素组与中药组最终体重及增重量均无显著性差异。故认为，补肾壮骨颗粒对快速老化雄性小鼠的体重变化无显著性影响。

表1 各组小鼠体重变化Table 1 Weight change of mice in each group

注：与MG对比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;与GHG对比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.2 骨生物力学性能

表2结果显示，与正常组对比，3个月与6个月后模型组的股骨结构力学参数均降低，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，表明模型组小鼠抗压能力减弱，脆性增加，此结果符合快速老化雄性小鼠的生长特性；与模型组对比，3个月后生长激素组和中药组的股骨结构力学参数均有提高，且差异具有显著性(P<0.01)，6个月后生长激素组和中药组的结构力学参数亦均有提高，其中生长激素组弹性载荷、最大绕度和最大弯矩差异具有统计学意义(P<0.05)，中药组最大载荷和弹性载荷差异具有统计学意义(P<0.05)；与生长激素组对比，3个月后中药组最大载荷、弹性载荷、最大绕度、能量吸收和最大弯矩均略有提高，但无统计学意义(P>0.05)，6个月后中药组弹性载荷、最大绕度、最大弯矩及能量吸收降低，但无统计学意义(P>0.05)。

表3所示，与正常组对比，3个月后模型组材料力学参数均降低，其中刚性系数和极限强度差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，6个月后模型组材料力学参数亦均有降低，但无统计学意义(P>0.05)；与模型组对比，3个月后生长激素组和中药组材料力学参数均提高，其中两组最大应力、弹性应力、刚性系数差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，6个月后生长激素组最大应力、弹性应力、刚性系数有所提高，弹性模量有所降低，无统计学意义(P>0.05)，中药组弹性应力、刚性系数有所提高，弹性模量有所降低，无统计学意义(P>0.05)，最大应力基本无改变；与生长激素组对比，3个月后中药组最大应力、弹性应力提高，无统计学意义(P>0.05)，刚性系数和弹性模量降低，无统计学意义(P>0.05)，6个月后中药组股骨材料力学参数均降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组骨结构力学参数的结果Table 2 Results of mechanical parameters of bone structure in each group

注：与MG对比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;与GHG对比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

表3 各组骨材料力学参数的结果Table 3 Results of mechanical parameters of bone materials in each group

注：与MG对比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;与GHG对比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.3 股骨宏观几何结构和皮质骨面积

如表4和表5，与正常组对比，3个月和6个月后模型组股骨外径及其横截面积无显著性差异，内径及其横截面积增大，差异有显著性(P<0.01或P<0.05)，皮质骨厚度及其横截面积减小，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；与模型组对比，3个月后生长激素组和中药组股骨外径、骨横截面积增大，无统计学意义(P>0.05)，内径、骨髓腔横截面积减小，皮质骨厚度及其横截面积增大，差异有显著性(P<0.01或P<0.05)，6个月后生长激素组外径及其横截面积增大，内径及其横截面积减小，无统计学意义(P>0.05)，皮质骨厚度及其横截面积增大，差异具有显著性(P<0.01)，中药组股骨外径及其横截面积增大，内径及其骨髓腔横截面积减小，皮质骨厚度及其横截面积增大，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；与生长激素组对比，3个月后中药组线性几何量和几何截面积无统计学意义差异(P>0.05)，6个月后中药组外径及其横截面积增大，内径及其横截面积减小，无统计学意义(P>0.05)，皮质骨厚度及其横截面积增大，差异具有显著性(P<0.01)。

表4 各组骨线性几何量的结果Table 4 Results of linear geometric figures of bone in each

注：与MG对比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;与GHG对比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

表5 各组骨几何截面积的结果Table 5 Results of geometric sectional area of bone in each

注：与MG对比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;与GHG对比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.4 股骨截面的力学几何量

如表6，与正常组对比，3个月后模型组股骨截面的力学几何量降低，有统计学意义(P<0.05)，6个月后模型组股骨截面的力学几何量有降低但无统计学意义(P>0.05)；与模型组对比，3个月后生长激素组和中药组股骨截面的力学几何量均有所增加，但无统计学意义(P>0.05)，6个月后生长激素组股骨截面的力学几何量均有所增加，其中抗扭截面模数和抗弯截面模数具有统计学意义差异(P<0.05)，中药组股骨截面的力学几何量均增大，差异具有显著性(P<0.01)；与生长激素组对比，3个月后中药组股骨截面力学几何量无差别，6个月后均有提高，但无统计学意义(P>0.05)。

表6 各组骨力学截面几何量的结果Table 6 Results of geometric section of bone mechanics in each

注：与MG对比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;与GHG对比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.5 骨量

如表7，与正常组相比，3个月及6个月模型组骨矿密度持续降低，但无统计学意义(P>0.05)；与模型组对比，3个月后生长激素组和中药组骨矿密度均降低，但无统计学意义(P>0.05)，6个月后生长激素组和中药组骨矿密度有所提高，但无统计学意义；与生长激素组对比，3个月和6个月后中药组骨矿密度均提高，但无统计学意义(P>0.05)。

表7 各组骨矿密度的结果Table 7 Results of bone mineral density in each

3 讨论

快速老化型小鼠(senescence accelerated mouse,SAM)具有全身广泛性骨量减少，骨组织微结构破坏，骨脆性增加，低峰值骨密度，低峰值骨量等特点，与人类老年性骨质疏松症表现相似，是研究老年性骨质疏松症的理想模型[6]。本次研究3月和6月后测得结果均显示模型组SAMP6小鼠较同期正常组SAMR1小鼠骨量减少，骨生物力学性能下降，皮质骨厚度减小，且SAMP6小鼠检测结果6月较3月骨质疏松症更为明显，符合此次老年男性骨质疏松模型的研究标准。

中医对骨质疏松的记载最早见于《黄帝内经》“刺腰痛”专篇。根据骨质疏松临床表现及发病机制，当属“骨痿”“骨痹”范畴。现代中医从辩证角度分析骨质疏松，认为本病的病症在于肾、脾、经络，其病机特点为肾脾虚和瘀血，肾虚是发病的根本，瘀血是重要原因[7]。补肾壮骨颗粒是综合了补肾、健脾、祛瘀理念并结合临床经验调配而成的中药复方，方中淫羊藿、鹿角胶、龟甲胶、骨碎补、巴戟天补肾阳、强筋骨、祛风湿，山药健脾和胃益肾，水蛭活血祛瘀止痛。诸药合用共奏补肾壮骨、健脾和胃、活血祛瘀之功效。现代药理学研究表明，淫羊藿有降低破骨细胞活性、活跃成骨细胞的作用；鹿角胶、龟甲胶有强壮的作用，能增强组织细胞的再生过程，提高机体适应性过程；巴戟天、骨碎补有调节性激素的作用，诸药配合组成的补肾壮骨颗粒有改善下丘脑-垂体-性腺轴功能，抑制骨吸收，促进骨形成。生长激素可以通过调节GH/IGF-1轴刺激成骨细胞的复制和骨基质的合成，防治中老年男性骨质疏松症的发生。

大量文献表明单纯测定骨密度不能发现包括器官和组织水平的结构特性信息，不能完全反映骨的力学完整性[8]。本研究显示前3个月补肾壮骨颗粒对SAMP6小鼠的骨含量并未起到积极作用，反而使骨含量降低，但骨生物力学有着显著性的改善，此结果也再次印证了单纯依靠测定骨密度来评价治疗骨质疏松药物疗效的不科学性；结合3月和6月后骨线性几何量的结果分析此现象，原因可能是补肾壮骨颗粒更多的促进SAMP6小鼠皮质骨成骨细胞的形成，对松质骨的影响较迟缓，使得股骨外径增大，但骨质空隙率改善不明显，进而使直观测量的骨矿密度降低；6个月后结果显示补肾壮骨颗粒提高了SAMP6小鼠的骨含量，且高于生长激素组，说明长期服用补肾壮骨颗粒对SAMP6小鼠松质骨有显著性的改善且优于生长激素，以上需对其骨微结构的研究加以确定。对于骨质疏松动物模型，任何治疗最重要的目是改善骨的生物力学性能。骨生物力学是通过研究骨组织在外界作用下的力学特性和生物学效应的特点，来反映骨量和骨内在结构以及骨组织的抗骨折能力的情况，是一种可评价各种对抗骨丢失措施的方法[9]。由骨生物力学性能结果得知，补肾壮骨颗粒治疗3个月后能够显著性改善SAMP6小鼠的骨结构力学性能(P<0.01或P<0.05)，提高最大应力、弹性应力和刚性系数(P<0.05)；治疗6个月后结构力学和材料力学参数也有所提高，其中最大载荷和弹性载荷差异具有统计学意义(P<0.05)，说明随着SAMP6小鼠年龄的增长，骨量丢失和骨脆性的加大，补肾壮骨颗粒在一定程度上可以改善SAMP6小鼠的股骨结构连续性，增加骨质韧性，增强骨强度，提高骨刚度及抗骨变性和骨折能力。两个用药组结果显示，补肾壮骨颗粒对SAMP6小鼠的骨生物力学性能影响与生长激素干预结果差异无统计学意义(P>0.05)，即补肾壮骨颗粒在改善SAMP6小鼠的生物力学性能方面可以与生长激素相匹敌。

早期研究表明，人体骨骼在基本发育过程中，股骨的截面几何结构呈现骨的外径不断增粗，骨髓腔直径渐渐扩大，骨皮质厚度和骨皮质面积不断增加，骨的截面几何模量不断增大，骨骼的稳定性和力学强度大大增加，以适应人体体重及活动增加的力学要求。骨的这种截面宏观几何结构的变化是符合结构力学原理(结构分布离中心越远，结构力学性能越优)的生理结构代偿机制,即骨几何结构生物力学应答调节机能。随着年龄的增长和器官的老化进而导致骨生物力学应答调节机能的减弱也是老年期骨生物力学性能下降的主要原因[10-11]。本次对SAMP6小鼠股骨截面几何结构的研究证明，补肾壮骨颗粒能够改变SAMP6小鼠股骨内外经显著性增加皮质骨厚度，减小骨髓腔面积，增大皮质骨面积，提高骨的截面惯性矩、抗弯截面模数、极惯性矩、抗扭截面模数(P<0.01或P<0.05)，且6个月后中药组皮质骨厚度和横截面积较生长激素组有显著性增大(P<0.01)，即补肾壮骨颗粒比生长激素更能促进或加强SAMP6小鼠的股骨宏观几何结构的生物力学应答调节机能，积极影响骨的生物力学性能。

综上可推断，补肾壮骨颗粒应具有调节老年男性骨质疏松症患者的骨宏观几何结构的力学应答机能的功能，进而改善骨的生物力学性能，增强骨质韧性，增加骨强度，提高抵抗外力变形和骨折的能力，其效果与生长激素相当，故可以考虑选择价格便宜且安全的补肾壮骨颗粒替代价格昂贵且风险较大的生长激素对老年男性骨质疏松症的治疗。