UPLC-MS/MS法同时测定党参中7种核苷的含量

张艳丽 杨雁芸 白志尧 曹彦刚 孙亚萍 刘 通 克迎迎

1.河南中医药大学药学院，河南郑州 450046；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州 450046

党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素 花 党 参 Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或 川 党 参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根[1]。其性甘味平，具有补中益气、健脾益肺之功效，是中药中具有代表性的补益药物，在临床上应用广泛。现代研究表明，党参水提液具有调节血糖[2]、增强免疫力[3]、促进造血机能[4]、提高学习记忆能力[5]、调节胃收缩及抗溃疡[6]、抗衰老[7]等作用。核苷是生物细胞维持生命活动重要元素，参与代谢过程，具有抗肿瘤[8]、抗病毒[9]、调节免疫功能[10]等多种药理作用，被认为是补益类中药共有的物质基础。超高效液相色谱-质谱联用具有卓越的分离能力、高选择性，高灵敏度，快速简便等优点，越来越多地应用于中药材微量和痕量成分的检测[11-12]。目前在党参质量评价方面，以党参炔苷的含量为指标，而关于核苷类成分的含量测定，尚未见到相关文献报道。本实验通过参照其他有关核苷成分含量测定的相关报道[13-14]，对党参中7种核苷成分进行了定性、定量分析，为党参的化学成分、药理作用，和多指标质量控制提供了科学依据。本实验采用UPLC-MS/MS联用技术对4批不同来源党参饮片中腺苷、肌苷、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、次黄嘌呤和2'-脱氧腺苷7种核苷类成分进行含量测定，为党参药材的质量控制提供参考。

1 材料与仪器

ACQUITY系统超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和Masslynx 4.1质谱工作站（美国 Waters公司）；AB135-S型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Centrifuge-5418小型高速低温冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BT25S万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；XK80-A快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）；KQ-300DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；DFZ-60508型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

腺 苷（批 号：Z23S7J21814）、肌 苷（批 号：TJ0623XA13）、尿 嘧 啶（批 号：T14A8X33880）尿 苷（批 号：TM0313XA13）、腺 嘌 呤（批 号：X18N6M6005）、次黄嘌呤（批号：TM0313XA13）、2'-脱氧腺苷（批号：N27A8W34890）对照品购自上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%；甲醇、乙腈（色谱纯，Thermofisher公司），甲酸（质谱级，Thermofisher公司），实验用水为超纯水。4批党参饮片购买于郑州各大药房，来源见表1，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液

精密称取腺苷等7种对照品，分别置于10mL容量瓶中，加10%甲醇溶解并定容，摇匀，分别得含腺苷80.3μg/mL、肌苷84.1μg/mL、尿嘧啶82.8μg/mL、 尿苷 82.5μg/mL、腺嘌呤 79.9μg/mL、次黄嘌呤90.5μg/mL和2'-脱氧腺苷89.6μg/mL单一成分对照品溶液储备液，量取各储备液配置成系列浓度的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液

称取党参药材粉末（过3号筛）约1g，精密称定，置25mL具塞锥形瓶中，精密加入10%甲醇10mL，称定质量，超声（250W，40kHz）提取 30min，放冷至室温，以10%甲醇补足减失重量。12000r/min离心2次，每次5min，取上清液过0.22μm微孔滤膜过滤得供试品溶液。

2.3 色谱条件

采 用 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～ 3 min，5% ～ 10%A；3～ 5min，10% ～ 15%A；5～ 9min，15% ～ 5%A；9～10 min，5%A）；柱温30℃；流速：0.2mL/min；进样量：2μL。

2.4 质谱条件

采用电喷雾电离源（ESI），正离子扫描；检测模式：多反应监测（MRM）；毛细管电离电压3.5kV；离子源温度150℃；去溶剂气N2，流速300L/h，去溶剂气温度300℃；碰撞氩气，流速0.3mL/min。7种核苷类化合物在MRM模式下质谱分析条件见表2，MRM离子流图见图1。

图1 7种核苷样品的MRM

2.5 线性关系、检出限和定量限

取“2.1”项下制备的系列浓度的混合对照品溶液，按“2.2”和“2.3”项下条件重复进样测定3次，记录各个化合物特征碎片离子峰面积，以对被测成分的质量浓度（X，mg/L）为横坐标，对照品的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。以信噪比S/N=3和S/N=10时计算被检测化合物的检测限（LOD）和定量限（LOQ），见表3。结果表明，7种核苷类成分在各自浓度范围内线性关系良好（R2≥0.9976），检测限为0.032～4.614μg/L，定量限为0.163～15.817μg/L。

2.6 精密度实验

取上述同一混合对照品溶液，按“2.2”和“2.3”项下色谱条件连续进样6次，每次2μL，测定峰面积，结果显示7种核苷类成分峰面积的RSD为0.93%～2.71%，表明该方法有较好的精密度。

表2 优化的质谱条件参数

表3 党参中7种核苷的标准曲线、检出限及定量限

表4 党参中7种核苷同时测定方法的加样回收率考察结果（n=3）

2.7 重复性实验

按“2.2”项下方法制备供试品（17071001）6份，分别制备供试品溶液，进样分析，结果显示7种核苷类化合物含量的RSD值1.26%～2.29%，表明实验所建立的方法重复性良好。

2.8 稳定性实验

取批号为17071001的党参样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在优化后的实验条件下，分别于0、2、4、6、8、10h 进样测定，结果显示 7 种核苷含量的 RSD为0.82%～2.98%，表明供试品溶液在10h内稳定。

2.9 回收率实验

称取已知含量批号为17071001的党参样品1g，6份，精密称定，分别精密加入低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液，按“2.2”项下方法制备加样回收率供试品溶液，按“2.3”和“2.4”项下进行UPLC-MS/MS测定，记录峰面积，计算各个化合物的平均加样回收率和RSD，结果见表4，表明本方法在3个浓度添加水平下，7种核苷类成分的加样回收率为95.56%～104.03%，RSD均＜3.0%，能满足党参药材中7种核苷类成分的测定要求。

表5 党参中7种核苷的含量（μg/g，n=3）

2.10 样品测定

分别精密称取不同批号的样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述优化好的条件进行7种核苷类成分的含量测定，把各组分峰面积代入回归方程计算得到样品中7种核苷的含量，结果见表5。

3 讨论

3.1 提取方法的考察

本文考察了提取溶剂（水、0.1%甲酸水、10%甲醇、30% 甲醇、50% 甲醇），溶剂用量（5、10、25、50mL），超声提取时间（10、30、45、60min），实验结果表明，最终确定的“2.2项”下供试品溶液的制备方法为最优方法。

3.2 色谱-质谱条件的考察

Acquity UPLC BEH C18柱采用三键键合化学，对强极性的化合物具有很好的保留作用，适用于核苷类成分的分离。另外本文对常用流动相乙腈-水系统、甲醇-水系统、甲醇-0.1%甲酸水系统进行了考察，实验结果显示甲醇-0.1%甲酸水系统作为流动相时7种核苷类化合物的灵敏度高于乙腈-水系统和甲醇-水系统，分离效果较好，出峰紧凑且峰型对称。核苷类化合物在正离子模式下的响应较负离子模式更为稳定，因此选择正离子模式作为质谱的离子化模式。

党参为临床常用补益类中药，核苷作为补益类中药共有的物质基础，制定其快速稳定的含量测定十分必要。文献报道腺苷具有改善血液循环，防止心律失常[15]等活性。随着现代药理学及核苷的系列产品开发利用，核苷在制备增强机体免疫力的食品、药品和保健品中广泛应用。核苷类含量测定方法主要有反相高效液相色谱法和毛细管电泳法，然而，核苷类化合物极性较强、化学结构相似，在反相柱上不易保留、分离度低及共流出的问题，给分离分析带来挑战。超高效液相色谱法（UPLC）是利用小颗粒填料（＜2μm）作为固定相和超高压系统（＞105kPa）的新型色谱技术，与传统高效液相法相比具有高分离度、高分辨率、高检测灵敏度等优势，同时结合三重四级杆多反应离子监测母离子和子离子的质谱响应信号，从而获取灵敏度高和重现性好的定性和定量离子，实现更加准确的定性定量，避免假阳性的结果。

本实验所建立的UPLC-MS/MS法可同时对党参中得腺苷、肌苷、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、次黄嘌呤和2'-脱氧腺苷7种核苷进行定量测定，实验结果显示不同批次党参药材中7种核苷含量差异不大，且腺苷的含量最高，远高于其他成分，肌苷、次黄嘌呤、尿苷、2'-脱氧腺苷的含量较低，不同批次党参中核苷类成分含量有所差异，其原因可能与药材生长气候条件、土壤情况及采收时期等多种因素有关。本实验建立的UPLC-MS/MS法可快速、准确地同时测定党参中7种核苷类成分的含量，该方法简单、快速、稳定、可靠，为提高党参药材以及含党参中成药的质量标准提供了参考。